Analisis

Asam
Amino

Analisis
Protein
Analisis Analisis
Kuantitatif Kualitatif
Analisis Kuantitatif
1. Metode Kjeldahl

Metode ini merupakan metode yang sederhana untuk penetapan nitrogen total pada asam amino,

protein, dan senyawa yang mengandung nitrogen. Sampel didestruksi dengan asam sulfat dan

dikatalisis dengan katalisator yang sesuai sehingga akan menghasilkan amonium sulfat. Setelah

pembebasan alkali dengan kuat, amonia yang terbentuk disuling uap secara kuantitatif ke dalam

larutan penyerap dan ditetapkan secara titrasi.

Penetapan Kadar Prosedur :

a. Timbang 1 g bahan yang telah dihaluskan, masukkan dalam labu Kjeldahl (kalau kandungan

protein tinggi, misal kedelai gunakan bahan kurang dari 1 g).

b. Kemudian ditambahkan 7,5 g kalium sulfat dan 0,35 g raksa (II) oksida dan 15 ml asam sulfat

pekat.

c. Panaskan semua bahan dalam labu Kjeldahl dalam lemari asam sampai berhenti berasap dan

teruskan pemanasan sampai mendidih dan cairan sudah menjadi jernih. Tambahkan

pemanasan kurang lebih 30 menit, matikan pemanasan dan biarkan sampai dingin.
d. Selanjutnya tambahkan 100 ml aquadest dalam labu Kjeldahl yang didinginkan dalam air es dan

beberapa lempeng Zn, tambahkan 15 ml larutan kalium sulfat 4% (dalam air) dan akhirnya

tambahkan perlahan-lahan larutan natrium hidroksida 50% sebanyak 50 ml yang telah didinginkan

dalam lemari es.

e. Pasanglahlabu Kjeldahl dengan segera pada alat destilasi. Panaskan labu Kjeldahl perlahan-lahan
sampai dua lapis cairan tercampur, kemudian panaskan dengan cepat sampai mendidih.

f. Destilasi ditampung dalam Erlenmeyer yang telah diisi dengan larutan baku asam klorida 0,1N

sebanyak 50 ml dan indikator merah metil 0,1% b/v (dalam etanol 95%) sebanyak 5 tetes, ujung

pipa kaca destilator dipastikan masuk ke dalam larutan asam klorida 0,1N.

g. Proses destilasi selesai jika destilat yang ditampung lebih kurang 75 ml. Sisa larutan asam klorida

0,1N yang tidak bereaksi dengan destilat dititrasi dengan larutan baku natrium hidroksida 0,1N.

Titik akhir titrasi tercapai jika terjadi perubahan warna larutan dari merah menjadi kuning. Lakukan

titrasi blanko.
 Kadar Protein

Kadar protein dihitung dengan persamaan berikut :

Kadar = V NaOH blanko V NaOH sampel x N NaOH x 14,008 x 100% x Fk

berat sampel (mg)

Keterangan :

Fk : faktor koreksi Fk N : 16
 2. Metode Biuret
Uji untuk mengetahui adanya
ikatan peptida dari suatu sampel
Prosedur Kerja
a. Sebanyak 3 mL larutan protein
ditambah 1 mL NaOH 10% dan
dikocok.
b. ditambahkan 1-3 tetes larutan
CuSO4 0.1%.
c. diamati timbulnya warna.
d. Ion Cu2+ akan membentuk ikatan
kompleks berwarna ungu dengan
peptida pada kondisi alkali
 3. FTIR (Fourier Transform
Infrared)
Sinar inframerah
dilewatkan
dalam sampel.
Gelombang
diteruskan, dan
ditangkap oleh
detektor.
Komputer akan
memberikan
gambaran spektrum
sampel.
Struktur kimia dan
bentuk ikatan molekul
sampel menjadi dasar
bentuk spektrum yang
diperoleh.
 4. Lowry
Merupakan Menentukan
modifikasi dari konsentrasi protein
metode Biuret. berdasarkan reaktivitas
Memerlukan sedikit peptida nitrogen
sampel (0,005-0,3 dengan ion tembaga
mg protein/mL). (II).
Jumlah protein diketahui Reduksi Folin-
dengan membaca Ciocalteay
absorbansi pada 750 phosphomolybdic
nm pada produk akhir phosphotungstic acid
reaksi Folin terhadap menjadi
kurva standar dari heteropolymolybdenum
larutan protein standar blue dari oksidasi
copper-catalyzed.
Langkah metode Lowry.
Sumber:(http://web.itu.edu.tr/~dule
kgurgen/Proteins.pdf)
 5. Bradford (Dye-
Binding)

Ikatan Coomasie Blue G250 dengan protein

menyebabkan perubahan absorbsi maksimum reagen
dari 465 nm (merah) menjadi 595 nm (biru) pada
larutan asam.
Reagen ditambahkan kepada sampel, dan absorbansi
diukur pada 595 nm.
Semakin banyak konsentrasi protein, semakin intens
warna biru yang terjadi.
Analisis Kualitatif
 Liquid Chromatography Mass
Spectrometry (LCMS)
Kromatografi cair-spektrometri massa (Liquid
chromatography-mass spectrometry atau LC-MS)
adalah teknik kimia analisis yang merupakan
penggabungan dari pemisahan fisik menggunakan
kromatografi cair dan deteksi massa molekul
dengan spektrometri massa. Keunggulan dari teknik ini
adalah spesifisitas dan sensitivitas pengukuran yang
dihasilkan sangat tinggi dibandingkan teknik kimia
analis lainnya. Selain itu, bila
dibandingkan kromatografi gas dan kromatografi cair
kinerja tinggi (HPLC), LC-MS juga memiliki kapasitas
yang lebih besar untuk menganalisa sampel yang lebih
banyak dalam sekali waktu
Prinsip Kerja
Pertama-tama, sampel yang akan dianalisa dengan LC-MS pertama-tama akan melalui
kromatografi cair untuk memisahkan komponen-komponen yang ada pada sampel.
Selanjutnya, komponen-komponen atau molekul tersebut akan dilanjutkan ke spektrometri
massa. Molekul tersebut dapat akan melalui proses ionisasi yang dapat dilakukan dengan
berbagai cara. Namun, salah satu teknik ionisasi yang palings sering digunakan
adalah electrospray ionisation (ESI).
Sampel yang berupa cairan akan dipompa melalui kapiler dan diubah menjadi tetesan yang
berukuran sangat kecil.
Selanjutnya tetesan-tetesan tersebut akan diubah menjadi fase gas dengan menggunakan
panas dan nitrogen. Dalam proses ini, muatan listrik dari tetesan tersebut akan berpindah ke
molekul yang ingin dideteksi. Molekul yang akan dideteksi dapat bermuatan positif atau
negatif dan dapat dideteksi oleh mesin sesuai pengaturan yang diinginkan.[2]
Selanjutnya, spektrometri massa yang terdiri dari empat batang metal yang tersusun secara
pararel akan melakukan seleksi molekul yang ingin dideteksi berdasarkan rasio massa
terhadap muatan (mass-to-charge ratio, m/z) masing-masing molekul.
Molekul dengan rasio m/z yang tidak diinginkan akan dibuang, sedangkan molekul atau analit
dengan m/z rasio yang diinginkan akan diteruskan ke detektor. Detektor akan menghasilkan
puncak-puncak apabila molekul yang diinginkan terdapat pada sampel
 Kristalografi (Sinar X)
Menggunakan difraksi Sinar X
untuk mengetahui struktur
suatu molekul
Saat Sinar X mengenai suatu
kristal, akan terbentuk titik-
titik difraksi dalam bentuk
peta scatter seperti pada
sitometri
Peta scatter ini dapat
diterjemahkan oleh
komputer untuk mengetahui
struktur asli dari molekul Eksperimen densitas elektron pada struktur DNA.
penyusun kristal tersebut Sumber: (www.rscb.org/pdb
/101/static101.do?p=eduction_discussion
/Looking-at-Structures/methods.html)
 Spektroskopi Nuclear Magnetic
Resonance
NMR menggunakan fenomena
dimana inti atom akan menyerap
dan mengeluarkan kembali
radiasi elektromagnetik saat
ditempatkan pada medan
magnet
Radiasi ini dapat digunakan untuk
mengetahui jenis atom yang
berada pada medan magnet
Struktur protein dapat diketahui
dengan jelas karena atom-atom
pada molekul diketahui

Beberapa restrain digunakan untuk memecahkan struktur

untuk monomeric hemoglobin kecil.
(Sumber:(www.rscb.org/pdb/101/static101.do?p=
eduction_discussion/Looking-atStructures/methods.
html)
 Mikroskopi Elektron
Sinar elektron Metode ini
digunakan untuk telah terbukti
menggambarkan
molekul secara berguna untuk
langsung. struktur
Hasilnya berupa multimolekular
gambar 3D. seperti ribosom,
Difraksi elektron tRNA, dll.
digunakan untuk
memetakan densitas
3D.
Metode mikrografi The tail of the T4 bacteriophage has been
elektron sering examined by combining electron microscopy
and atomic structures. Sumber :

digabung dengan (www.rscb.org/pdb/101/static101.do?p=eductio

n_ discussion/Looking-at Structures/

kristalisasi X-ray atau methods.html)

spektroskopi NMR.
 Circular Dichroism Spectroscopy
UV dekat: = 250-
Dapat mendeteksi 320 nm, sensitif
struktur sekunder
terhadap perubahan
dan tersier protein.
struktur tersier
UV jauh: = 190-250
berdasarkan interaksi
nm. Membutuhkan
antar protein, dan
20- 200 L larutan
atau perubahan
yang mengandung 1
mg/mL kondisi pelarut.
hingga 50 g/mL, Kekuatan sinyal pada
pada buffer yang UV dekat sangat
tidak memiliki lemah dibandingkan
absorbansi tinggi sinyal pada UV jauh.
pada region Membutuhkan
spektrum ini. sekitar 1 mL larutan
protein ( 0,5 hingga
1 mg/mL protein).
 Western Blotting

Meliputi 3 hal, yaitu:

o Pemisahan berdasarkan ukuran protein.
o Perpindahan protein ke membran.
o Menandakan protein target dengan
menggunakan antibodi primer dan
sekunder.
 Sel dilisiskan
Dicampurkan Menggunakan antibodi
dengan Leammli primer dan sekunder
buffer yang yang telah dilabeli
PREPARASI mengandung SDS IMMUNOB enzim.
dan BME Antibodi berikatan
Disentrifugasi
LOTTING dengan epitope.
dan Antibodi dapat
dipanaskan membedakan protein
Protein dipisahkan tertentu diantara protein
berdasarkan ukurannya. lainnya.
ELEKTROFO
Dihubungkan dengan
RESIS GEL powersupply dengan
tegangan yang Proses ini bergantung
disesuaikan. pada enzim yang
berikat dengan antibodi
sekunder.
Protein berpindah ke DETEKSI Enzim yang biasa
TRANSFER membran digunakan adalah HRP,
Transfer (Nitroselulosa atau
MEMBRAN dan substratnya
Membra Chemiliminescent.
n PVDF)
Terdapat dua jenis Warna dapat dideteksi
teknik, Transfer oleh film
basah dan semi
basah.
Analisis Asam Amino
 1. Uji Ninhidrin
Uji Ninhidrin adalah uji umum
untuk protein dan asam
amino.
Ninhidrin dapat mengubah
asam amino menjadi suatu
aldehida.
Uji ninhidrin dilakukan dengan
menambahkan beberapa tetes
larutan ninhidrin yang tidak
bewarna ke dalam sampel,
kemudian dipanaskan
beberapa menit.
Adanya protein ditunjukkan
oleh terbentuknya warna
ungu.
 2. Uji Xantoproteic/Xantoproteat
Merupakan uji terhadap
protein yang
mengandung gugus fenil
(cincin benzena).
Apabila protein yang
mengandung cincin
benzena dipanaskan
dengan asam nitrat pekat,
maka terbentuk warna
kuning yang kemudian
menjadi warna jingga bila
dibuat alkalis (basa)
dengan larutan NaOH.
 3. Uji Paulys Diazo
Terjadi proses diazotization karena adanya
sodium nitrite dan hydrohydrochloric acid, dan
menghasilkan garam diazonium

Garam diazonium membentuk pasangan

dengan tirosin atau histidin pada medium basa
untuk menghasilkan warna merah.