2.

Cut and
Ligation
Pemotongan pada Rekayasa
Genetika
OUTLINE
- Pemotongan Plasmid dan DNA
- Definisi Enzim Restriksi
- Prinsip Kerja Restriksi
- Jenis Enzim Restriksi
- Penyambungan Plasmid dan DNA
- Definisi Ligase
- Prinsip Kerja Ligase
- Jenis Enzim Ligase
2
Restriksi adalah..

▪ Enzim yang dapat memotong molekul

plasmid dan DNA
▪ Disebut juga dengan Endonuklease
Restriksi
▪ Mempunyai sekuens pengenalan yang
unik pada utas DNA (sepanjang 4-6 pb)

3
Jenis Enzim Restriksi
(Berdasarkan Komposisi Subunit)

Enzim Restriksi Enzim Restriksi Enzim Restriksi

Tipe I Tipe II Tipe III

4
Jenis Enzim Restriksi
(Berdasarkan Komposisi Subunit)

Enzim Restriksi Tipe I

 Kompleks dengan multisubunit
 Memotong DNA secara acak dan jauh dari sekuens
pengenalannya
 Tidak dapat menghasilkan potongan fragmen DNA yang
diinginkan
 Tidak diproduksi
5
Jenis Enzim Restriksi
(Berdasarkan Komposisi Subunit)

Enzim Restriksi Tipe II

 Memotong DNA dekat atau pada situs pengenalan
 Menghasilkan fragmen-fragmen sesuai dengan yang
diinginkan
 Biasa digunakan untuk analisis DNA dan kloning gen
 Contoh : HhaI, HindIII, EcoRI, dan NotI

6
Jenis Enzim Restriksi
(Berdasarkan Komposisi Subunit)

Enzim Restriksi Tipe III

 Tidak digunakan dalam laboratorium
 Memotong di luar situs pengenalan
 Membutuhkan dua sekuen dengan orientasi berlawanan pada
DNA yang sama untuk menyelesaikan pemotongan

7
Tiga Tipe Restriksi
Tipe I Tipe II Tipe III

Kompleks multienzim yang

Komponen Komponen
mengandung subunit R
Komposisi subunit enzim subunit enzim
(endonuclease), M (metilase),
terpisah terpisah
dan S (spesifikasi)

Struktur Subunit
Heterodimer Homodimer Heterodimer
Nuklease

Kofaktor ATP, SAM, Mg2+ Mg2+ Mg2+

Di daerah 25-27 dari

Acak (100-1000 dari Restriction
Sisi Pemotongan Restriction sites Restriction
sites)
atau didekatnya sites
8
Jenis Enzim Restriksi
(Berdasarkan Perkiraan Pemotongan)

6-cutters 8-cutters 4-cutters

memiliki situs memiliki situs memiliki situs
pemotongan yang pemotongan yang pemotongan yang
spesifik sepanjang spesifik sepanjang spesifik sepanjang
6 nukleotida 8 nukleotida 4 nukleotida

9
Ligase adalah..

Enzim yang mengkatalisis

pembentukan ikatan
fosfodiester antara ujung
5’-fosfat dan 3’-hidroksil
yang digunakan saat
proses ligasi pada DNA
yang mengalami
pemotongan (Gul S et al.
2004). 10
Ligase bekerja
dengan prinsip..
▪ Menyambung 2 ujung
DNA ujung 3’OH untai
satu dengan ujung 5’P
untai lain
▪ Mengkatalis ikatan
fosfodiester antara
kedua ujung DNA
▪ Melepas AMP dan enzim
adenylate 11
Ligase bekerja dengan prinsip..
▪ Memotong DNA pada rangka gula-
fosfat tanpa merusak basa
▪ Restriction sites adalah daerah yang
simetri dengan poliandrom (kedua utas
DNA dibaca dengan arah yang sama
akan memberikan urutan yang sama
pada nukleotidanya)
▪ Pemotongan enzim restriksi akan
menghasilkan ujung kohesif (sticky end) 12
Jenis Enzim Ligase

Topoisomerase
T4 DNA Ligase
Transposase
E. Coli DNA Ligase
Rekombinase

13
Jenis Enzim Ligase
T4 DNA Ligase
▪ Berasal dari T4
bakteriofag
▪ Meligasi fragmen DNA
yang menggantung,
memiliki ujung kohesif
atau ujung tumpul
▪ Dapat menyambungkan
blunt ended (A) dan sticky
ended (B)
14
Jenis Enzim Ligase
E. Coli DNA Ligase
▪ Dihasilkan oleh bakteri E. Coli
▪ Kofaktornya berupa NAD+

Topoisomerase
▪ Membuat irisan yang akan memutuskan DNA
backbone
▪ Bertanggung jawab dalam proses pembukaan
double helix DNA 15
Jenis Enzim Ligase
Transposase
▪ Mengikat pada akhir
transposon
▪ Mengkatalisis pergerakan
transposon ke bagian
genom lain

16
Jenis Enzim Ligase
Rekombinase
▪ Mengkatalisis reaksi
pertukaran DNA spesifik
untuk setiap rekombinasi
▪ Reaksi ini memungkinkan
empat modul fungsional
dasar yaitu eksisi/sisipan,
inversi, translokasi dan
pertukaran

17