KELOMPOK 2

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

Kromatografi lapisan tipis

 Kromatografi lapisan tipis (KLT)
adalah suatu
teknik kromatografi yang
digunakan untuk memisahkan
campuran yang tidak volati.
dilakukan pada selembar kaca,
plastik, atau aluminium foil yang
dilapisi dengan lapisan tipis
bahan adsorben, biasanya silika
gel, aluminium oksida ,
atau selulosa.

Kromatografi lapisan tipis dapat

digunakan untuk memonitor
pergerakan reaksi,
mengidentifikasi senyawa yang
terdapat di dalam campuran, dan
menentukan kemurnian bahan
 Deteksi bercak pemisahan pada KLT dapat
dilakukan dengan cara-cara berikut:
METODE
KROMATOGRAFI a. menyemprot lempeng KLT dengan reagen
kromogenik yang akan bereaksi secara kimia
LAPIS TIPIS dengan seluruh solut yang mengandung gugus
fungsional tertentu sehingga bercak menjadi
berwarna. Kadang-kadang bercak dipanaskan
terlebih dahulu untuk mempercepat reaksi
pembentukan warna dan intensitas warna
bercak
b. mengamati lempeng di bawah lampu ultraviolet
Pemilihan pelarut yang dengan panjang gelombang 254 atau 366 nm
digunakan untuk senyawa untuk menampakkan solut sebagai bercak
yang akan dianalisis yang gelap atau bercak yang berfluoresensi
dengan metode KLT, harus terang pada dasar yang berfluoresensi
dapat melarutkan analit c. menyemprot lempeng dengan asam sulfat
dengan sempurna, mudah pekat atau asam nitrat pekat lalu dipanaskan
menguap, viskositas untuk mengoksidasi solut-solut organik yang
rendah, serta dapat akan nampak sebagai bercak hitam
membasahi lapisan kecoklatan
penyerap (Sherma and
Fried, 1996). d. memaparkan lempeng dengan uap iodium
dalam chamber tertutup
e. melakukan scanning pada permukaan
lempeng dengan densitometer
1.Pembuatan pelarut (metanol pH 4)
Dibuat campuran metanol dan asam asetat glasial dengan
perbandingan 9:1.

2. Pembuatan fase gerak

Fase gerak yang digunakan dalam penelitian menggunakan
campuran kloroform : asam asetat glasial (95:5). Fase gerak dibuat
dalam labu ukur 100 mL kemudian digojog.

3. Pembuatan larutan baku kurkumin

Pembuatan larutan stok kurkumin 1000 ppm. Sejumlah lebih kurang
10,0 mg baku kurkumin ditimbang seksama kemudian dilarutkan dalam
metanol pH 4 hingga volume tepat 10,0 mL.
Pembuatan seri larutan baku. Sebanyak 0,250 mL; 0,375 mL; 0,500 mL;
0,625 mL; 0,750 mL; dan 0,875 mL larutan stok kurkumin diambil dan
dimasukkan ke dalam labu ukur 5 ml kemudian diencerkan dengan
metanol pH 4 hingga tanda, sehingga didapatkan konsentrasi 50 ppm,
75 ppm, 100 ppm, 125 ppm, 150 ppm, dan 175 ppm.
4. Penetapan panjang gelombang maksimum
Seri larutan baku konsentrasi 50 ppm, 100 ppm, dan 175 ppm masing-
masing ditotolkan dengan volume penotolan 3 µL pada plat KLT
dengan fase diam silika gel G 60 dan setelah kering dikembangkan
dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhi dengan fase gerak.
Setelah mencapai jarak rambat 10 cm, plat dikeluarkan dari bejana
dan dikeringkan. Plat hasil pengembangan kemudian secepatnya
discanning panjang gelombang serapan maksimumnya dengan
densitometer.

5. Pembuatan kurva baku dan pengamatan nilai Retardation Factor

(Rf) kurkumin
Seri larutan baku konsentrasi 50 ppm, 75 ppm, 100 ppm, 125 ppm, 150
ppm, dan 175 ppm masing-masing ditotolkan dengan volume
penotolan 3 µL pada plat KLT dengan fase diam silika gel G 60 dan
setelah kering dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah
dijenuhi dengan fase gerak. Setelah mencapai jarak rambat 10 cm,
plat dikeluarkan dari bejana dan dikeringkan. Plat hasil
pengembangan kemudian secepatnya diukur AUC dan tinggi
peaknya dengan densitometer. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali
dan pilih persamaan kurva baku yang paling baik. Selain itu dilihat
pula nilai Rf dari masing-masing seri baku kurkumin.
6. Penentuan recovery dan Coefficient of Variations (CV) baku
Seri larutan baku konsentrasi 50 ppm, 100 ppm, dan 175 ppm diberi
perlakuan seperti pada poin F.5. Replikasi dilakukan sebanyak 5 kali.
Selanjutnya dihitung kadar terukur dengan menggunakan persamaan
kurva baku yang telah dibuat pada poin F.5. Berdasarkan data ini dapat
ditentukan recovery dan CVnya.

7. Penentuan recovery dan Coefficient of Variations (CV) baku dalam

matriks sampel
Pembuatan larutan sampel (LS). Sejumlah lebih kurang 15,0 mL sampel
ditambah metanol pH 4 hingga volume 25,0 mL. Larutan sampel
kemudian didegasing selama 15 menit dan disaring dengan kertas
saring. Larutan hasil penyaringan ditambah metanol pH 4 hingga volume
25,0 mL.
Pembuatan larutan sampel dengan penambahan baku kurkumin (LSK).
Sejumlah 0,125 mL larutan sampel kurkumin dimasukkan dalam labu
takar 5 mL, kemudian ditambahkan 4,5 mL LS dan ditambahkan metanol
pH 4 hingga tanda. Replikasi dilakukan sebanyak 5 kali.
Pengembangan dan pengukuran. LS dan LSK diberi perlakuan seperti
pada poin F.5. Setelah itu dihitung kadar baku kurkumin dalam sampel
menggunakan persamaan kurva baku yang telah dibuat pada poin F.5.
Kadar baku kurkumin dalam sampel adalah selisih kadar LSK dengan
kadar LS. Selanjutnya dihitung recovery dan CVnya.
 SPEKTROFOTOMETRI

Tiga daerah panjang gelombang

Spektrofotometri adalah suatu
elektromagnetik yang digunakan:
metode dalam kimia analisis yang
1.Daerah UV (200-380 nm)
digunakan untuk mengukur
2. Daerah Visible (380-700 nm),
konsentrasi sampel secara
3. Daerah Inframerah (700-3000 nm)
kuantitatif, berdasarkan interaksi
materi dengan cahaya.

Prinsip kerja
spektrofotometri
berdasarkan hukum
Lambert-Beer, bila cahaya
monokromatik melalui
suatu media (larutan),
maka sebagian cahaya
tersebut akan diserap.
 Analisis Vitamin B6 (Piridoksin) pada
Sediaan Tablet Multivitamin Neurotropik
Menggunakan Spektrofotometri UV-Vis

 Analisis vitamin B6 menggunakan  Spektrofotometri UV-Vis adalah

spektrofotometri UV Vis
berlangsung cepat sehingga
mampu menghambat degradasi
senyawa sehingga hasil analisis
yang diperoleh lebih akurat.
 Vitamin B6 (piridoksin) diperlukan
dalam beberapa proses
metabolisme. Tubuh
membutuhkan vitamin B6 untuk
reaksi lebih dari 100 enzim,
perkembangan otak selama masa
kehamilan, serta fungsi kekebalan
tubuh.
suatu metode analisis yang simple.
Kelebihan lain dari metode analisis
ini adalah cepat, tidak
memerlukan biaya yang besar
dan mudah dilakukan.
Jumlah sampel dan pelarut yang
dibutuhkan juga sedikit, namun
tetap memberikan hasil yang
akurat. Analisis yang cepat akan
memberikan efisisensi waktu dalam
mengerjakannya. Kemungkinan
terjadinya kerusakan vitamin B6
yang dilarutkan pada pelarutnya
sebelum dianalisis juga dapat
dicegah.
 Ditimbang 10,0 mg baku vitamin B6 kemudian dilarutkan
menggunakan aquades 10,0 ml. Larutan ini distirer kemudian disaring
menggunakan kertas whattman. Membuat baku vitamin B6 100 ppm,
dengan cara dipipet 1,0 ml dari baku induk dilarutkan dalam 10,0 ml
aquades, kemudian digunakan untuk menetapkan panjang
gelombang maksimal.
 Penetapan Kadar Vitamin B6 Dalam Sampel Penetapan kadar
vitamin B6 dalam sampel vitamin neurotropik 20 tablet kemudian
dihitung bobot kemudian dihaluskan. Timbang sampel yang sudah
menjadi serbuk sesuai bobot rata tablet. Masukkan dalam labu ukur
100,0 ml tambah aquades sampai batas. Stirer larutan tersebut
kemudian sentrifuse.
 Hasil sentrifuse disaring menggunakan kertas whatman. Ambil 1,0 ml
larutan masukkan dalam labu ukur 10,0 ml, ditambah aquades
sampai batas. Kemudian dianalisis menggunakan spektrofotometri
UV pada panjang gelombang maksimal. Catat nilai absorbansinya
untuk dihitung kadarnya menggunakan per diperoleh dari kurva
baku.
 Penentuan panjang gelombang maksimal dilakukan dengan
menggunakan standar baku vitamin B6 pada kadar 100 ppm.
Pada analisis vitamin B6 menggunakan pelarut air karena
piridoksin termasuk vitamin larut air.
 Penentuan panjang gelombang maksimal dilakukan dengan
cara scaning pada panjang gelombang 200- 400 nm. Vitamin B6
memberikan serapan pada daerah UV sehingga untuk analisis
spektrofotometri serapan dibaca pada panjang gelombang
antara 200 nm sampai dengan 400 nm.
 Panjang gelombang maksimal untuk analisis vitamin B6 adalah
325 nm yang memberikan serapan 0,558 A. Nilai serapan optimum
analisis menggunakan spektrofotometri adalah 0,2 sampai 0,8 A,
sehingga nilai serapan saat penentuan panjang gelombang
maksimal telah sesuai.
Vitamin B6 (piridoksin)dalam sampel neurotropik dapat
di analisis dengan menggunakan Spektrofotometri UV-
VIS menggunakan pelarut air. Analisis vitamin B6
menggunakan Spektrofotometri UV-VIS merupakan
metode analisis yang simple, mudah, efisien biaya,
serta memerlukan sampel dan pelarut dalam jumlah
sedikit. Berdasarkan hasil tersebut, maka metode KLT-
densitometri ini memiliki validitas yang baik untuk
menetapkan kadar kurkumin dalam sampel OHT
Kiranti®.

Kesimpulan