BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Tujuan praktikum

 Menentukan absorbsi vitamin B1

 Menentukan kurva kalibrasi
 Menentukan kadar vitamin B1

1.2 Dasar Teori

A. Spektrofotometri UV-Vis

Spektrum UV-Vis merupakan hasil interaksi antara radiasi elektromagnetik

(REM) dengan molekul atom dari suau zat kimia. Tekhnik yang sering digunakan
dalam analisis farmasi meliputi spektroskopi serapan ultraviolet, cahaya tampak,
inframerah dan serapan atom. Jangkauan yang tersedia untuk pengukuran membentang
dari panjang gelombang pendek ultraviolet sampai inframerah. Spektroskopi absropsi
serapan berguna untuk mengkarakterisasikan gugus fungsi dalam suatu molekul dan
untuk ultra violet-cahaya tampak digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantiatif
spesies kimia.
Spektrofotometer dapat digunakan untuk mengukur besarnya energi yang diabsorbsi
atau diteruskan. Jika radiasi yang monokromatik melewati larutan yang mengandung
zat yang dapat menyerap, maka radiasi ini akan dipantulkan, diabrorbsi oleh zatnya dan
sisanya ditransmisikan.

1
Lombert dan Beer telah menurunkan secara empirik hubungan antara intensitas cahaya
yang ditransmisikan dengan tebalnya larutan dan hubungan antara intensitas tadi
dengan konsentrasi zat.
Hukum Lombert-Beer :
𝑙𝑜
A = log = y.b.c = a.b.c
𝑙𝑖

Dimana : A = serapan
lo = intensitas sinar yang datang
li = intensitas sinar yang diteruskan
y = absortivitas molekular ( mol.cm.𝑙1−1 )
a = daya serap
b = tebal larutan / kuvet
c = konsentrasi ( 9.1-1.mg.ml-1 )
Penyimpangan-Penyimpangan Hukum Beer :
Pada konsentrasi rendah, grafik hubungan dari serapan dengan konsentrasi biasanya
merupakan garis lurus.Pada konsentrasi yang lebih tinggi kurva ini dapat membelok
kearah absis atau ordinat. Penyimpangan ini disebabkan oleh kondisi percobaan yang
sudah tidak dipenuhi lagi, yaitu :
1. Cahaya tidak cukup monokromatis
2. Cahaya sampingan (stay radiation) mengenai detektor
3. Kepekaan detektor berubah
4. Intensitas sumber cahaya dan amplifier dari detektor berubah-ubah karena tegangan
tidak stabil
5. Pada desiasi-asosiasi keseimbangan kimia berubah, misalnya pada perubahan pH
larutan.
6. Larutan berfluoresensi. Suhu larutan berubah selama pengukuran.

2
Jenis-Jenis Spektrofotometer UV-Vis :

1. Single Beam
a. Celah keluar sinar monokromatis hanya satu
b. Wadah / kuvet yang dapat dilalui sinar hanya satu
c. Setiap perubahan panjang gelombang, alat harus dinolkan
2. Double Beam
a. Celah keluar monokromatis ada dua
b. Wadah melalui dua kuvet sekaligus
c. Alat cukup satu kali dinolkan dengan cara mengisi kedua kuvet dengan larutan
blanko

Penggunaan Spektrofotometer UV-Vis :

Spektrofotometer UV-Vis digunakan terutama untuk analisa kuantitatif, tetapi dapat

juga untuk analisa kualitatif. Yang perlu diperhatikan dalam analisa kualitatif :

1. Membandingkan λ maksimum
2. Membandingkan serapan (A), daya serap (a)
3. Membandingkan spektrum serapannya

Faktor-faktor yang Mempengaruhi Spektrum Serapan :

1. Jenis Pelarut (Polar, Non Polar)

Pelarut yang umum digunakan adalah air, etanol, methanol, dan n-heksan
2. pH larutan
3. Kadar larutan, jika konsentrasi tinggi akan terjadi polimerisasi yang menyebabkan
λ maksimum berubah sama sekali atau harga lo < la
4. Tebal larutan, jika digunakan kuvet dengan tablet berbeda akan memberikan
spektrum serapan yang berbeda
5. Lebar celah
Makin lebar celah (Slit Width) maka makin lebar pula serapan (Band Width),
cahaya polikromatis, resolusi dan puncak-puncak kurva tidak sempurna.

3
Analisa Kuantitatif :

Untuk analisa kuantitatif dilakukan langkah-langkah sebagai berikut :

1. Pembuatan Spektrum Serapan

Dari zat murni / standar
2. Pembuatan Kurva Kalibrasi
3. a. Pembuatan Larutan Standar
Diukur pada λ maks
b. Pengenceran Sample

Pembuatan spektrum serapan bertujuan untuk memperoleh panjang gelombang

maksimum dan senyawa tersebut dari konsentrasi yang biasa digunakan antara 5-10
ppm. Panjang gelombang maksimum perlu kita cari, karena akan digunakan untuk
penetapan kadar.

Penetapan kadar dilakukan pada λ maksimum dengan alasan sebagai berikut :

1. Pada λ maksimum diperoleh serapan maksimum, dimana perubahan serapan karena

konsentrasi juga maksimum, sehingga menghsilkan kepekaan dan keakuratan yang
lebih tinggi.
2. Pada pita panjang gelombang maksimum ini, daya serap juga relatif konstan,
sehingga diperoleh kurva kalibrasi yang linier.
3. Pada λ maksimum bentuk serapan pada umumnya landai, sehingga kesalahan
penempatan / pembacaan λ dapat diabaikan.

-Bagian yang Penting dari Spektrofotometri UV-Vis :

1. Sumber Cahaya
Sumber cahaya yang biasa digunakan pada spektrofotometer UV-Vis ada 3 yaitu :
 Tungsten Lamp, bekerja pada panjang gelombang 300 – 2500 nm
 Halogen Lamp, bekerja pada panjang gelombang 300 – 2500 nm. Memiliki
life time 1000 jam (lebih mahal dibanding tungsten lamp)
 Deuterium Lamp, bekerja pada panjang gelombang 160 – 400 nm (daerah
UV). Lampu ini memiliki life time 500 jam.
2. Monokromator
Monokromator adalah alat optis yang berfungsi untuk mengisolasi suatu berkas
radiasi sumber berkesinambungan, berkas mana mempunyai kemurnian spectral

4
 yang tinggi dengan panjang gelombang apa saja yang diinginkan. Pada
spektrofotometer UV-Vis monokromator ada 3 jenis :
 Prisma, digunakan untuk range panjang gelombang 165-2500 nm,
memberikan disperse dan resolusi yang baik pada daerah 185-300 nm,
 Grating, memberikan resolusi yang lebih baik untuk range panjang
gelombang UV dan inframerah dekat.
3. Kuvet
Kuvet/sel merupakan wadah sampel yang akan dianalisis. Kuvet ini harus lah
mampu meneruskan energi cahaya dalam daerah spectral yang dikhendaki. Ditinjau
dari pemakaiannya kuvet ada 2 macam yaitu kuvet yang permanen terbuat dari gelas
atau leburan silica dan kuvet disposibel untuk satu kali pakai, yang terbuat dari
teflon atau plastic. Menurut bahan pembuatannya kuvet ada dua macam yaitu :
 Fused Silica (Quartz Cell) dengan daerah pengukuran 180-2500 nm
 Glass dengan daerah pengukuran 340-2500 nm.

Kuvet terdapat dalam bermacam-macam bentuk ukuran sesuai kebutuhan analisa.

Pada analisa dengan spektrofotometer UV-Vis, kuvet memiliki ukuran panjang
jalan sinar yang khas yaitu setebal 1 cm.

4. Detektor
Detektor berguna untuk memberikan respon terhadap cahaya pada berbagai panjang
gelombang atau sebagai pengubah sinyal radiasi yang diterima menjadi sinyal
elektronik.
5. Amplifier
Amplifier berfungsi sebagai penguat sinyal elektronik yang dihasilkan oleh
detector.
6. Display
Display adalah monitor untuk menampilkan spectrum atau absroban sampel yang
diuji.

B. Monografi Bahan

Thiamini Hydrochloridum (Vitamin B1)

Thiamini Hydrochloridum mengandung tidak kurang dari 98,0% dan tidak lebih dari
101,0% C12H17C1N4OS.HCl, dihitung terhadap zat yang telah dikeringkan.

5
Pemerian : Hablur kecil atau serbuk hablur; putih; bau khas lemah mirip ragi;
rasa pahit.
Kelarutan : Mudah larut dalam air, sukar larut dalam etanol (95%)P; praktis
tidak larut dalam eter P dan dalam benzen P; larut dalam gliserol P.
Identifikasi
A : Spektrum serapan inframerah zat yang telah dikeringkan pada suhu
1050 selama 2 jam dan didispersikan dalam kalium bromida P,
menunjukkan maksimum hanya pada panjang gelombang yan
sama seperti pada tiamini hydrochloridum PK.
B : Larutan 2% b/v menunjukkan reaksi Klorida yang tertera pada
reaksi identifikasi.
Serapan larutan tidak lebih dari 0,025; penetapan dilakukan
sebagai berikut : larutkan 1,0 g dalam air secukupnya hingga 10,0
ml saring dengan penyaring kaca mesir berpori halus. Ukur serapan
1 cm larutan pada 400 nm terhadap blanko air.
Penyimpanan : dalam wadah tertutup baik, terlindung dari cahaya.

6
 BAB II

METODOLOGI PERCOBAAN

2.1 Tempat dan Waktu

 Tempat pengambilan data praktikum dilaksanakan Di Laboratorium Fisika Farmasi
Politeknik Kesehatan KementrianKesehatan Jakarta II
 Waktu pengambilan data praktikum dilaksanakan pada hari Rabu tanggal 11 Mei2019
pada pukul 13.00-16.00 WIB

2.2 Alat dan Bahan

 Alat
1. Spektrofotometer UV-Vis 6. Corong
2. Labu ukur 7. Kertas saring
3. Pipet volume 8. Botol Semprot
4. Erlenmeyer 9. Pipet tetes
5. Beaker glass 10. Tissue
 Bahan
1. Aquadest
2. Vitamin B1 baku murni
3. Vitamin B1 sampel

2.3 Prosedur kerja

1. Penentuan absorbsi dan panjang gelombang maksimum vitamin B1 baku murni

a. Timbang seksama 100,0 mg Vitamin B1 murni, masukkan dalam labu ukur
tambahkan aquadest ad 100 ml, kocok ad homogen.
(Larutan Baku induk = 1015 ppm)
b. Dari larutan baku induk pipet sebanyak 10 ml dengan pipet dengan pipet volume,
kemudian masukkan dalam labu ukur 100 ml + aquadest ad 100 ml ( 101.5 ppm )
c. Ukur absorbsi larutan tersebut pada spektrofotometer dengan aquadest sebagai
blanko pada panjang gelombang mulai 223 nm s/d 244 nm, cari panjang gelombang
maksimumnya λ max = 232 nm, A(1%, 1cm) = 566

7
 2. Penentuan kurva kalibrasi vitamin B1 murni :
a. dari larutan induk baku murni buat lima seri larutan dengan konsentrasi berbeda
dengan rumus A = a.b.c yang diambil langsung dari larutan vitamin B1 101.5 ppm

b. Pipet dari larutan vitamin B1 konsentrasi 101.5 ppm dengan volume masing-masing
konsentrasi yang telah ditentukan masukkan dalam labu ukur yang sesuai.
Tambahkan aquadest ad batas labu ukur.

c. Ukur absorbsi masing-masing larutan tersebut dengan spektrofotometer dengan

aquadest sebagai blanko pada panjang gelombang mulai 223 – 244 nm. Cari panjang
gelombang maksimum.

d. Dari data tersebut dapat diperoleh nilai a, b, dan r, buat kurva kalibrasi dan persamaan
kalibrasinya.

3. Penetapan kadar Sample Vitamin B1 :

a. Timbang seksama 100,0 mg sample vitamin B1 dalam bentuk serbuk . masukkan
dalam beaker glass.
b. Larutkan dalam aquadest ad 100 ml (larutan induk sample)
c. Dari larutan induk sample, pipet 1 ml, masukkan dalam labu ukur tambahkan
aquadest ad 100 ml
d. Untuk absorbsi larutan sample pada λ maksimum dengan aquadest sebagai blanko.
e. Hitung kadar vitamin B1 dalam sample

2.4 Perhitungan Penentuan Kurva Kalibrasi

Panjang gelombang maksimum Vitamin B1
λ maks = 232 nm ( 𝐴11 = 566 a )
= 1g/100ml
= 1000 mg/100ml
= 10.000 ppm
A = a.b.c A = a.b.c
566 = (a).(1).(10.000) 0,15 = (0,0566).(1).(c)
A = 0,0566 c = 2,65 ppm

Syarat A = 0,15 – 0,85

Untuk A min = 0,15

8
 A = a.b.c
0,85 = (0,0566).(1).(c)
Untuk A maks = 0,85 c = 15,01 ppm

 Bahan Vitamin B1 yang ditimbang 0,100 gram (Larutan induk I)

0,1000 𝑔𝑟𝑎𝑚 1000
= = 1000 𝑝𝑝m
1 𝑚𝑙 1 𝑚𝑙

 Larutan baku induk II

V1 X N1 = V2 X N2
V1 x 1000 ppm = 100 ml x 100 ppm
10000 𝑚𝑙.𝑝𝑝𝑚
V1 = = 10 ml
1000 𝑝𝑝𝑚

Untuk membuat 5 seri larutan, konsentrasinya mulai dari 2 – 15 ppm

Perhitungan :
100 𝑝𝑝𝑚 𝑥 𝑝𝑖𝑝𝑒𝑡
 3 ppm = = 3 ml add100 ml
100 𝑚𝑙
100 𝑝𝑝𝑚 𝑥 𝑝𝑖𝑝𝑒𝑡
 5 ppm = = 5 ml add 100 ml
100 𝑚𝑙
100 𝑝𝑝𝑚 𝑥 𝑝𝑖𝑝𝑒𝑡
 7 ppm = = 7 ml add 100 ml
100 𝑚𝑙
100 𝑝𝑝𝑚 𝑥 𝑝𝑖𝑝𝑒𝑡
 9 ppm = = 9 ml add 100 ml
100 𝑚𝑙
100 𝑝𝑝𝑚 𝑥 𝑝𝑖𝑝𝑒𝑡
 10 ppm = = 10 ml add 100 ml
100 𝑚𝑙

Pembuatan kurva kalibrasi

Cara kerja :
1. 3 ppm
Ambil 3 ml larutan Vitamin B1 baku 100 ppm menggunakan pipet volume
3 ml, masukkan dalam labu ukur 100 ml tambahkan aquadest ad 100 ml, kocok ad
homogen.
2. 5 ppm
Ambil 5 ml larutan Vitamin B1 baku 100 ppm menggunakan pipet volume
5 ml, masukkan dalam labu ukur 100 ml tambahkan aquadest ad 100 ml, kocok ad
homogen.
3. 7 ppm
Ambil 7 ml larutan Vitamin B1 baku 100 ppm menggunakan pipet volume

9
 7 ml, masukkan dalam labu ukur 100 ml tambahkan aquadest ad 100 ml, kocok ad
homogen.
4. 9 ppm
Ambil 9 ml larutan Vitamin B1 baku 100 ppm menggunakan pipet volume
9 ml, masukkan dalam labu ukur 100 ml tambahkan aquadest ad 100 ml, kocok ad
homogen.
5. 10 ppm
Ambil 10 ml larutan Vitamin B1 baku 100 ppm menggunakan pipet volume
10 ml, masukkan dalam labu ukur 100 ml tambahkan aquadest ad 100 ml, kocok ad
homogen.

10
 BAB III

HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1 Hasil Praktikum

A. Tabel Spektrum Serapan Larutan Vitamin B1 pada Konsentrasi 7 ppm
Λ (nm) Absorben (A) Λ (nm) Absorben (A)
223 0,1906 234 0,2540
224 0,1992 235 0,2520
225 0,2079 236 0,2483
226 0,2164 237 0,2430
227 0,2248 238 0,2361
228 0,2323 239 0,2275
229 0,2389 240 0,2179
230 0,2447 241 0,2073
231 0,2494 242 0,1967
232 0,2524 243 0,1862
233 0,2540 244 0,1767

B. Tabel Kurva Kalibrasi, λ maks = 233 nm

Konsentrasi Absorben
3 ppm 0,1069
5 ppm 0,1832
7 ppm 0,2462
9 ppm 0,3203
10 ppm 0,3610

Dari hasil perhitungan dengan menggunakan kalkulator, diperoleh data :

a = 0.0003
b = 0,0358
r = 0,9994

11
C. Grafik kurva kalibras

ABSORBANSI
0.5 0.3610
y = 0.0358x + 0.0003
0.3203
0.4 R² = 0,9976
0.1832 0.2462
0.3 0.1069
ABSORBANSI
0.2
Linear (ABSORBANSI)
0.1

0
0 2 4 6

D. Perhitungan Kadar
Absorben sample yang diperoleh pada λ maks 233 nm
a = 0.0003
b = 0.0358
r = 0,9994
A = 0,1757

Y = a + bx
0.1757 = (0.0003) + (0,0358) x
0,0358 x = 0,1757-0,0003
x = 4,899 µg/ml
100 𝑚𝑙 100𝑚𝑙
Fp = x x 100 ml
10 𝑚𝑙 5 𝑚𝑙

= 20.000 ml

Kadar = x. Fp
= 4,9 ppm x 20.000 ml
= 98000 ppm
= 98000 µg
= 98 mg
98 𝑚𝑔
= 100 𝑚𝑔 𝑥 100%

= 98%

12
3.2 Pembahasan

Pada praktikum ini adalah penetapan kadar vitamin B1 dengan metode spektrofotometri
UV. Zat yang dianalisis menggunakan spektrofotometri UV adalah zat dalam bentuk
larutan dan zat tersebut tidak tampak berwarna, jika zat tesebut berwarna maka perlu
direaksikan dengan reagen tertentu sehingga dihasilkan suatu larutan tidak berwarna.
Pada hasil praktikum ini penentuan absorbsi dan panjang gelombang vitamin B1 murni
menggunakan panjang gelombang mulai dari 222-242 nm, dan λ maximal yang diperoleh
233 nm dengan serapannya adalah 0,2540. Lalu penentuan kurva kalibrasi dengan
menggunakan λ max 233 nm pada konsentrasi 3 ppm serapannya sebesar 0.1069,
konsentrasi 5 ppm serapannya 0,1832, konsentrasi 7 ppm serapannya 0,2462, konsentrasi
9 ppm serapannya 0,3203 dan pada konsentrasi 10 ppm serapannya adalah 0,3610. Pada
saat pembacaan serapan semua larutan , digunakan blanko yaitu aquadest, karena blanko
berfungsi untuk menetralkan atau menghilangkan absorbansi dari pelarut dalam sampel ,
sehingga yang terbaca pada saat absorban hanya absorbansi dari sampel tanpa ada
gangguan dari pelarut.
Dari 5 konsentrasi yang telah diuji absorbansinya maka diperoleh nilai :
 a = 0,0003
 b = 0,0358
 r = 0,9976
absorban sampel vitamin B1 yang diperoleh adalah A= 0,1757 dan hasil kadar sampel
yang di dapat adalah 98%.

13
 BAB IV

KESIMPULAN DAN SARAN

4.1 Kesimpulan

1. Absorbansi maksimal yaitu pada panjang gelombang maksimum 233 nm

2. Kadar vitamin B1 sampel yang diperoleh adalah 98%; memenuhi syarat menurut
Farmakope Indonesia edisi IV hal 784 (Tiamin Hidroklorida mengandung tidak kurang
dari 98,0% dan tidak lebih dari 102,0%)

4.2 Saran

1. Praktikan harus teliti dalam menimbang, memipet, meng ad kan bahan atau sampel
yang akan digunakan
2. Pastikan semua alat yag digunakan dalam keadaan bersih
3. Alat-alat dan bahan yang digunakan pada saat praktikum lebih diperbanyak agar pada
saat praktikum dapat lebih praktis dan efisien dalam waktu

14
 BAB V
DAFTAR PUSTAKA

1. Farmakope Indonesiaedisi III.1979.Jakarta : Departemen Kesehatan Republik

Indonesia
2. Farmakope Indonesia edisi IV.Jakarta : Departemen Kesehatan Republik Indonesia
3. Martin. Alfred dkk. Farmasi fisik edisi ketiga. 1933. Universitas Indonesia. Jakarta.
4. Panduan Praktikum Fisika Farmasi.

15