LAPORAN PRAKTIKUM

INSTRUMENTATION & BIOMOLECULAR TECHNIQUE

SPECTROPHOTOMETRY

OLEH:
IRYASTI YUDISTIA

NIM: 176070100011006

PROGRAM MAGISTER ILMU BIOMEDIK

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2018
 LAPORAN I
SPECTROPHOTOMETRY

A. PENDAHULUAN
1 Tujuan : Menentukan konsentrasi suatu zat dalam larutan
berdasarkan nilai absorbansi yang diukur dengan
menggunakan spektrofotometer.
2 Waktu : Rabu, 14 Februari 2018
3 Tempat : Labroratorium Sentral Biomedik Fakultas Kedokteran
Universitas Brawijaya.

B. LANDASAN TEORI
Metode pengukuran menggunakan prinsip spektrofotometri adalah
berdasarkan absorpsi cahaya pada panjang gelombang tertentu melalui sualu
larutan yang mengandung kontaminan yang akan ditentukan konsentrasinya.
Proses ini disebut "absorpsi spektrofotometri". Jika panjang gelombang yang
digunakan adalah gelombang cahaya tampak, maka disebut sebagai
"kolorimetri", karena memberikan warna. Selain gelombang cahaya tampak,
spektrofotometri juga menggunakan panjang gelombang pada gelombang
ultraviolet dan infra merah. Prinsip kerja dari metode ini adalah jumlah cahaya
yang diabsorpsi oleh larutan sebanding dengan konsenlrasi kontaminan dalam
larutan (Lestari, 2010). Pada analisis secara spektrofotometri, terdapat tiga
daerah panjang gelombang elektromagnetik yang digunakan, yaitu daerah UV
(200 380 nm), daerah visible (380 - 700 nm) dan daerah inframerah (700 3000
nm) (Khopkar, 2003).
Metode Spektrofotometri Ultra-violet dan Sinar Tampak telah banyak
diterapkan untuk penetapan senyawa-senyawa organik yang umumnya
dipergunakan untuk penentuan senyawa dalam jumlah yang sangal kecil.
Prinsip kerjanya berdasarkan penyerapan cahaya atau energi radiasi yang
diserap memungkinkan pengukuran jumlah zat penyerap dalam larutan secara

2
 kuantitatif. Metode Spektrofotometri Ultra-violet dan Sinar Tampak
berdasarkan pada hukum Lambert-Beer (Triyati, 1985).
Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban
suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Spektrometer menghasilkan
sinar dari spectrum dengan panjang gelombang tertentu. Pada spektrofotometer,
pnjang gelombang yang benar-benar terseleksi dapat di peroleh dengan bantuan
alat pengurai cahaya seperti prisma. Suatu spektrofotometer tersusun dari
sumber spektrum tampak yang kontinyu, monokromator, sel pengabsorbsi
untuk larutan sampel atau blanko dan suatu alat untuk mengukur perbedaan
absorbsi antara sampel dan blanko ataupun pembanding (Eka, 2007 ).

C. ALAT DAN BAHAN

1. Alat:
Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah sebagai berikut:
a. Spektrofotometer UV-VIS
b. Seperangkat Komputer
c. Tabung Cuvet
d. Incubator
e. Tabung reaksi
f. Mikropipet & tip

2. Bahan:
Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah sebagai berikut:
a. Reagen Biuret :
- CuSo4 0,075 gram
- Kalium Natrium Tartrat 0,3 gram
- + NaOH 2,5 M 15 ml
- dd H2O s/d 50 ml
- + KI 0,05 gram
b. BSA (Bovine Serum Albumin)
c. Akuades
d. PBS (Phospat Buffer Saline)

3
D. PROSEDUR KERJA
Prosedur kerja yang dilakukan dalam praktikum ini adalah sebagai berikut:

1. Membuat stok srandart BSA=10 mg/ml=0,01 gram/ml

2. a. Membuat standart BSA dari stok standart BSA yang dibuat sebelumnya
NO Volume BSA Volume Akuades Konsentrasi
yang dipipet (pengencer) Standart BSA
1. 3,13 Mikroliter 996,9 Mikroliter 0,03125 mg/ml
2. 6,25 Mikroliter 993,8 Mikroliter 0,0625 mg/ml
3. 12,5 Mikroliter 987,5 Mikroliter 0,125 mg/ml
4. 25 Mikroliter 975 Mikroliter 0,25 mg/ml
5. 50 Mikroliter 950 Mikroliter 0,5 mg/ml
6. 100 Mikroliter 900 Mikroliter 1 mg/ml
7. 200 Mikroliter 800 Mikroliter 2 mg/ml
b. Sampel : 25 Mikroliter sampel+975 Mikroliter PBS
3. Masing-masing standart BSA yang dibuat diatas dan sampel (harus
dikerjakan bersamaan waktunya), ditambah 3 ml reagen biuret, dicampur
dengan di vortex
4. Diinkubasi di inkubator 37 derajat selama 30 menit
5. Diukur di spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm
Blangko : Aquades (sebagai titik nol)
Standart : Memakai standart BSA (Bovine Serum Albumin)
6. Hasil pengukuran dengan spektrofotometer: diperoleh Absorbansi
7. Absorbansi yang diperoleh dimasukkan ke rumus excel sehingga diperoleh
persamaan
y=ax+b,dimanaY=Absorbansi,X=KonsentrasixFp
(FaktorPengenceran=1000/25=40x).

E. HASIL
Hasil pengukuran dengan spektrofotometer, diperoleh absorbansi :

1. Standart BSA
NO Konsentrasi Standart BSA Absorbansi
1. 0,03125 mg/ml 0,051 A
2. 0,0625 mg/ml 0,053 A

4
 3. 0,125 mg/ml 0,063 A
4. 0,25 mg/ml 0,065 A
5. 0,5 mg/ml 0,076 A
6. 1 mg/ml 0,101 A
7. 2 mg/ml 0,191 A

2. Kurva Standart

3. Sampel
No Absorbansi Konsentrasi
1. 0,111 A 0,939 mg/ml
2. 0,21 A 2,388 mg/ml
3. 0,12 A 1,066 mg/ml

F. PEMBAHASAN
Spektrofotometri UV-Vis merupakan salah satu teknik analisis
spektroskopi yang memakai sumber radiasi eleltromagnetik ultraviolet dekat
(190-380) dan sinar tampak (380-780) dengan memakai instrumen
spektrofotometer. Spektrofotometri UV-Vis melibatkan energi elektronik yang
cukup besar pada molekul yang dianalisis.
Larutan standar dibuat dengan maksud untuk membuat kurva standar
atau kurva kalibrasi sehingga diperoleh panjang gelombang maksimum dari
larutan standar tersebut. Dipilih Panjang gelombang maksimum, hal ini karena
di sekitar panjang gelombang maksimum tersebut, bentuk kurva serapan adalah
datar sehingga hukum Lambert-Beer akan terpenuhi dengan baik sehingga
kesalahan yang ditimbulkan panjang gelombang maksimum dapat diperkecil.

5
Larutan mengnhasilkan warna komplementer yang dapat menyerap cahaya.
Warna-warna ini ditimbulkan oleh adanya panjang gelombang yang dimiliki
larutan tersebut. Setiap warna memiliki panjang gelombang yang berbeda-beda
dengan interval tertentu.
Berdasarkan percobaan, digunakan larutan standar dengan konsentrasi
0,03125 mg/ml, 0,0625 mg/ml, 0,125 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,5 mg/ml, 1 mg/ml
dan 2 mg/ml. Nilai absorbansi pada konsentrasi 0,03125 mg/ml adalah sebesar
0,051 A, pada konsenlrasi 0,0625 mg/ml sebesar 0,053 A, pada konsentrasi
0,125 mg/ml sebesar 0,063 A, pada konsentrasi 0,25 mg/ml sebesar 0,065 A,
pada konsentrasi 0,5 mg/ml sebesar 0,076 A, pada konsentrasi 1 mg/ml sebesar
0,101 A dan pada konsentrasi 2 sebesar 0,191 A. Nilai absorbansi sampel 1
sebesar 0,111 A, sampel 2 sebesar 0,21 A dan nilai absorbansi sampel 3 sebesar
0.12 A. Nilai konsentrasi sampel 1 sebesar 0,939 mg/ml, sampel 2 sebesar 2,388
mg/ml dan nilai konsentrasi larutan sampel 3 sebesar 1,066 mg/ml. Hasil
praktikum sesuai dengan Hukum Lambert-Beer yang berarti semakin tinggi
konsentrasi larutan standar maka semakin tinggi pula nilai absorbansinya.
Hasil praktikum didapatkan gambaran kurva regresi linier R2 = 0,976.
Hal ini merupakan nilai yang optimal dan dapat memberikan perhitungan
absorbansi yang tepat. Pada pembuatan kurva standar, garis X didapatkan dari
konsentrasi larutan standar dan garis Y di dapatkan dari nilai absorbansi larutan
standar. Hubungan antara X dan Y ini membentuk garis linier dalam grafik yang
menunjukan bahwa absorbansi adalah fungsi dari konsentrasi.
Terdapat sedikit perbedaan pada perhitungan dan kurva standar. Hal ini
dapat disebabkan karena kekurang telitian dalam pembuatan larutan serta
pengenceran yang kurang sempurna, terjadinya serapan radiasi oleh sidik jari
pada kuvet, sensitivitas alat, kuvet yang kurang bersih, adanya serapan oleh
pelarut, kuvet tergores, adanya gelembung udara atau gas dalam lintasan radiasi
panjang gelombang, ataupun kekurang telitian praktikan dalam pengamatan.

6
G. PENUTUP
1. Kesimpulan
Berdasarkan hasil pengamatan dan pembahasan dapat disimpulkan
bahwa:
a. Spektrofotometri adalah metode pengukuran berdasarkan hukum

Lambert-Beer, yang menyatakan bahwa jumlah sinar yang diserap atau

diteruskan oleh suatu larutan merupakan fungsi eksponensial dari

konsentrasi larutan dan tebal larutan yang dilalui sinar tersebut.

b. Kurva kalibrasi adalah kurva yang menunjukkan hubungan linier

antara konsentrasi larutan dengan absorbansi.
c. Hasil praktikum didapatkan gambaran kurva regresi linier R2 = 0,976.
d. Hasil praktikum sesuai dengan Hukum Lambert-Beer yang berarti
semakin tinggi konsentrasi larutan standar maka semakin tinggi pula
nilai absorbansinya.

2. Saran
-

7
 DAFTAR PUSTAKA

Eka. 2007. Metode Analisa Kimia-Spektrofotometri. Jakarta: Gramedia.

Lestari, F. 2010. Bahaya Kimia: Sampling & Pengukuran Kontaminan Kimia di
Udara. Jakarta: Buku Kedokteran EGC.
Khopkar, S.M. 2003. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: UI Press.
Triyati, E. 1985. Spektofotometer Ultra-Violet dan Sinar Tampak Serta Aplikasinya
dalam Oseanologi. Oseanografi, 1(1): 39-47.