LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA

SPEKTROFOTOMETRI
SEMESTER 116

Disusun oleh:
Garry Alexandro NIM 1308621017 Biologi B 2021

PROGRAM STUDI BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA
2022
 BAB 1
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Alat untuk mengukur absorbansi suatu larutan biasa disebut
dengan spektrofotometer. Sampel pada kuvet yang ada di dalam
spektrofometer akan dilewati oleh cahaya dengan panjang gelombang
tertentu. Cahaya tersebut akan diserap dan sisanya akan dilewatkan.
Metode analisis yang umum digunakan adalah dengan
spektrofotometer UV-Vis (Mulja, 1995).
Bahan kimia dapat menyerap dan menghantarkan cahaya. Suatu
larutan mempunyai warna tertentu karena larutan ini dapat menyerap
semua warna kecuali warna yang dapat ditangkap oleh mata.
Contohnya suatu larutan warna merah, karena larutan itu menyerap
cahaya pada daerah kuning-biru, sedangkan cahaya pada panjang
gelombang warna merah akan diteruskan sehingga dengan mata
tampak bewarna merah.
Mata kita dapat melihat spektrum cahaya dengan rentang
antara 400-800 nm. Cahaya dari sumber cahaya diuraikan dengan
menggunakan prisma sehingga diperoleh cahaya monokromatis yang
diserap oleh zat yang akan diperiksa itulah yang disebut dengan teknik
spektofotometri. Cahaya satu warna dengan satu panjang gelombang,
sehingga cahaya yang diserap oleh larutan bewarna dapat diukur
disebut cahaya monokromatis. Hubungan antara konsentrasi dengan
cahaya yang diserap dinyatakan dalam hukum Beer-Lambert
(Puspitaningrum, 2018).

1.2 Tujuan
1. Mengetahui dan memahami prinsip kerja alat spektrofometer.
2. Mengetahui cara mengkalibrasi alat spektrofometer.
3. Menentukan kadar larutan glukosa yang tidak diketahui.
 BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Spektrofometri
Spektrofotometri merupakan metode analisis kimia yang
berdasarkan interaksi energi dengan materi. Alat yang digunakan pada
praktikum ini adalah spektrofotometer. Alat tersebut dapat digunakan
unutk menganalisa suatu senyawa secara kuantitatif serta kualitatif.
Umumnya spektrofotometer yang digunakan adalah spektrofotometer
UV-Vis (Mulja, 1995).
Spektrometer merupakan alat yang digunakan dalam
pengukuran spektroskopi yaitu untuk mengukur absorbansi sinar
monokromatis oleh suatu larutan dengan cara melewatkan cahaya
pada panjang gelombang spesifik dengan menggunakan
monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detektor fototube oleh
suatu obyek kaca atau kuarsa yang disebut kuvetdengan sebagian dari
cahaya tersebut akan diserap dan sisanya akan dilewatkan. Nilai
absorbansi dari cahaya yang dilewatkan akan sebanding dengan
konsentrasi larutan di dalam kuvet (Suarsa, 2015).
2.2 Spektrofotometri UV-Vis
Spektrofotometri UV-Vis yang merupakan singkatan dari
spektrofometri sinar ultra violet dan visivle (cahaya tampak).
Pengukuran energi cahaya oleh suatu zat kimia pada panjang
gelombang maksimum tertentu merupakan dasar dari metode ini.
Sinar ultraviolet (UV) mempunyai panjang gelombang antara 200-400
nm, dan sinar tampak (visible) mempunyai panjang gelombang 400-
750 nm (Handbook, 2017). Metode ini menggunakan hukum Lambert-
Beer sebagai acuan dalam penentuan suatu zat secara kuantitatif.
Hukum Lambert-Beer merupakan hukum yang menyatakan
hubungan berbanding lurus antara absorban dengan konsentrasi
larutan analit dan berbanding terbalik dengan transmitan. Namun
demikian hukum ini memiliki beberapa pembatasan, yaitu:
a) Sinar yang dilewatkan harus dianggap monokromatis.
b) Penyerapan dilakukan dalam volume yang memiliki ketebalan yang
sama.
c) Zat kimia yang menyerap tidak tergantung pada zat yang lain dalam
larutan tersebut.
d) Tidak boleh ada fluorensensi atau fosforisensi.
e) Konsentrasi larutan mempengaruhi indeks bias (Iskandar, 2017).
 Hukum Lambert-Beer dinyatakan dalam persamaan (1).
A=e.b.c (1)
dimana:
A = absorban (serapan cahaya oleh zat kimia)
e = absorptivitas molar
b = tebal kuvet (cm)
c = konsentrasi
Ada beberapa hal yang harus diperhatikan dalam analisis
dengan spektrofotometri UV-Vis terutama untuk senyawa yang semula
tidak berwarna yang akan dianalisis dengan spektrofotometri visible
karena senyawa tersebut harusdiubah terlebih dahulu menjadi
senyawa yang berwarna. Tahapan-tahapan yang harus diperhatikan
sebagai berikut:
a. Pembentukan molekul yang dapat menyerap sinar UV-Vis.
Hal ini perlu dilakukan jika senyawa yang dianalisis tidak
menyerap padadaerah tersebut. Cara yang digunakan adalah dengan
merubah menjadi senyawalain atau direaksikan dengan pereaksi
tertentu.
b. Waktu operasional (operating time).
Cara ini biasa digunakan untuk pengukuran hasil reaksi atau
pembentukan warna. Tujuannya adalah untuk mengetahui waktu
pengukuran yang stabil.
c. Pemilihan panjang gelombang.
Panjang gelombang yang digunakan untuk analisis kuantitatif
adalah panjang gelombang yang mempunyai absorbansi maksimal.
Untuk memilih panjang gelombang maksimal, dilakukan dengan
membuat kurva hubungan antara absorbansi dengan panjang
gelombang dari suatu larutan baku pada konsentrasi tertentu.
d. Pembuatan kurva baku.
Dibuat seri larutan baku dari zat yang akan dianalisis dengan
berbagai konsentrasi. Masing-masing absorbansi larutan dengan
berbagai konsentrasi diukur, kemudian dibuat kurva yang merupakan
hubungan antara absorbansi (y) dengan konsentrasi (X).
e. Pembacaan absorbansi sampel atau cuplikan.
Absorban yang terbaca pada spektrofotometer hendaknya
antara 0,2 sampai0,8 atau 15% sampai 70% jika dibaca sebagai
transmitans. Anjuran ini berdasarkan anggapan bahwa kesalahan
dalam pembacaan T adalah 0,005 atau 0,5% (kesalahan fotometrik)
(Pulungan, 2019).
 Sebuah spektrofotometer memiliki lima bagian penting yaitu:
1. Sumber cahaya, untuk UV umumnya digunakan lampu deuterium
(D2O), untuk visible digunakan lampu tungstent xenon (Auc).
2. Monokromator, suatu alat yang berfungsi mengubah cahaya
polikromatik menjadi cahaya monokromatik.
3. Sel penyerap / wadah pada sample, cell dalam spektrofotometer
disebut juga dengan kuvet.
4. Photodetektor berfungsi untuk mengubah energi cahaya menjadi
energi listrik.
5. Analyzer (pengolah data), untuk spektrofotometer modern biasanya
dilengkapi dengan computer (Situmorang, 2019).
 BAB 3
METODOLOGI
3.1 Waktu & Tempat
Praktikum ini dilaksanakan pada hari Jumat, 8 April 2022.
Praktikum ini dilakukan di laboratorium Kampus B UNJ, Rawamangun,
Jakarta Timur.
3.2 Cara Kerja
1. Masukan larutan gula ke dalam kuvet tanpa menyentuh bagian
bening kuvet.
2. Taruh kuvet yang telah berisi larutan gula ke dalam alat
spektrofotometri.
3. Tekan tombol sesuai dengan instruksi.
4. Amati angka absorbansu yang tertera di alat spektrofotometri.
5. Catat hasilnya.
 BAB 4
HASIL & PEMBAHASAN
4.1 Hasil

Kurva Standar Glukosa

0,002

0,001 y = 2E-05x - 0,004

R² = 0,3176
0
0 50 100 150 200 250
-0,001

-0,002

-0,003

-0,004

-0,005

Grafik 1. Kurva Standar Glukosa

Pada praktikum kami mendapatkan angka absorbansi, sebagai

berikut:
• 50 ppm = -0,004 nm
• 100 ppm = - 0,002 nm
• 150 ppm = 0,001 nm
• 200 ppm = -0,002 nm

• X ppm = -0,002 nm
Pada kurva dapat didapatkan persamaan y= 2E-05x – 0,004,
sehingga nilai x ppm dapat disubtisusikan ke dalam persamaan.
y = x ppm
y = 2E-05x – 0,004 (1).
-0,002 = 2E-05x – 0,004
-0,002 = 0,05x – 0,004
-0,002 + 0,004 = 0,05x
X = 0,04 ppm
4.2 Pembahasan
Praktikum kali ini akan membahas tentang pengenalan
instrumen spektrofotometri UV-Vis, kalibrasi dan pengukuran panjang
gelombang maksimum. Tujuan dari percobaan ini adalah untuk
memahami prinsip kerja alat spektrofotometri UV-Visible, mengetahui
cara mengkalibrasi alat spektrofotometer UV-Visible, dan mengetahui
cara menentukan nilai kadar larutan glukosa yang tidak diketahui.
Praktikum kali ini menggunakan bahan seperti larutan glukosa
dan alat seperti spektrofotometer dan kuvet. Larutan 50 ppm, 100 ppm,
150 ppm, 200 ppm, dan x ppm dimasukkan ke dalam kuvet tanpa
memegang bagian yang bening kuvet. Kemudian ditekan tombol untuk
mendapatkan hasil angka absorbansi. Terdapat hasil angka absorbansi
yang didapatkan dengan hasil negatif (-). Hal tersebut kemungkinan
terdapat kesalahan dalam menjalankan cara kerja. Bagian bening kuvet
yang terpegang juga salah satu cara kerja yang salah sehingga
menyebabkan hasil absorbansi negatif (-).
Dihasilkan kurva kalibrasi dengan persamaan y = 0,1688+
0,01034x dan nilai koefien korelasi (r)0,9994. Angka ini mendekati 1
yang berarti terdapat kolerasi yang sangat tinggi antara absorban dan
kadar senyawa serta linieritas hubungan keduanya.
Pada praktikum kami mendapatkan angka absorbansi, sebagai
berikut:
• 50 ppm = -0,004 nm
• 100 ppm = - 0,002 nm
• 150 ppm = 0,001 nm
• 200 ppm = -0,002 nm
• X ppm = -0,002 nm
Kadar larutan glukosa didapatkan hasil 0,04 ppm.
 BAB 5
KESIMPULAN
Praktikum kali ini mengkaji tentang spektrofometri berdasarkan
larutan ujinya yaitu glukosa. Sampel pada kuvet yang ada di dalam
spektrofometer akan dilewati oleh cahaya dengan panjang gelombang
tertentu. Cahaya tersebut akan diserap dan sisanya akan dilewatkan. Cahaya
satu warna dengan satu panjang gelombang, sehingga cahaya yang diserap
oleh larutan bewarna dapat diukur disebut cahaya monokromatis. Percobaan
dilakukan dengan menggunakan alat spektrofometer dan larutan uji glukosa.
Konsentrasi larutan glukosa diketahui berturut-turut adalah 50 ppm, 100
ppm, 150 ppm, 200 ppm, dan x ppm. Sedangkan angka absorbansi yang
didapatkan berturut-berturut adalah -0,004, -0,002, 0,001, -0,002, dan -0,002.
 DAFTAR PUSTAKA
Handbook, Spectrophotometry. (2017). www.gelifesciences.com, 19 April
2017.
Iskandar, D. (2017). Perbandingan Metode Spektrofotometri UV-Vis dan
Idiometri dalam Penentuan Asam Askorbat Sebagai Bahan Ajar Kimia
Analitik Mahasiswa Jurusan Teknologi Pertanian Berbasis Open-ended
Experiment dan Problem Solving. Jurnal Teknologi Technoscientia. Vol.
10 No.1. ISSN: 1979-8415
Mulja, H, Muhammad, dan Suharman. (1995). Analisis Instrumental. Surabaya:
Airlangga University Press.
Pulungan, P, D. (2019). Penetapan Kadar Sirup Multivitamin Secara
Spektrofotometri Ultraviolet dengan Metode Double Divisor Ratio
Spectra Derivative. Skripsi
Puspitaningrum, Rini, et al. (2018). Penuntun Praktikum Biokimia untuk Prodi
Biologi.
Situmorang, et al. (2019). Modul Praktikum Instrumentasi. Jakarta: Uhamka
Press
Suarsa, W, I. (2015). Spektroskopi. Bali: Udayana Press