KROMATOGRAFI CAIR

LIQUID CHROMATOGRAPHY (LC)

KI3263 - ANALISIS INSTRUMENTASI KIMIA
INSTRUMENTASI
 Kromatografi Cair
A.) Pendahuluan

Liquid Chromatography (LC)

“chromatographic technique in which the mobile phase is a liquid”

LC adalah kromatografi yang muncul lebih dahulu dibanding GC, tapi dibayang-bayangi
perkembangan pesat GC pada era 1950-1960an

LC sekarang sudah lebih berkembang dan mengungguli GC

 LC VS GC
Kelebihan LC dibanding GC
1.) LC dapat dipergunakan untuk pemisahan sampel apapun yang dapat dilarutkan.
• LC lebih bermanfaat untuk senyawa biomolekul, polimer sintetik dan alami,
serta senyawa anorganik.

2.) Fasa gerak LC berupa cairan, sehingga memerlukan temperatur yg lebih rendah
• LC lebih cocok untuk memisahkan senyawa yang tidak stabil secara thermal

3.) Retensi sampel bergantung pada interaksi dengan fasa diam DAN fasa gerak.
• Retensi pada GC bergantung pada volailitas dan interaksi dengan fasa diam
• LC lebih fleksibel dalam optimasi (variasi fasa diam dan fasa gerak)

4.) Detektor LC umumnya non-destruktif

• Detektor GC umunya destruktif
• LC lebih cocok untuk preparatif

Kekurangan LC dibandingkan GC
1.) Kromatogram LC memiliki puncak-puncak yang cenderung melebar
• Koefisien difusi sampel dalam fasa gas akan lebih besar dibanding dalam
fasa cair
B.) Low- and High-performance Liquid Chromatography

Kromatografi cair tersedia dalam banyak tipe, bergantung pada kombinasi fasa diam
dan fasa gerak yang dipergunakan.
• Tiap-tipe LC memiliki karakteristik tertentu berdasarkan efisiensi dan kinerja
(performance)
Molecular mass
Low-performance liquid chromatography

• Metode LC yang mempergunakan fasa diam yang berukuran besar dan non-rigid
(diameter partikel > 40 μm)

• Efisisensi sitem yang rendah dan HETP yang tinggi, sehngga:

• Puncak yang lebar
• Limit deteksi yang jelek
• Waktu pemisahan yang lama
• Kolom hanya tahan tekanan rendah
• Biasanya memakai gravitasi atau pompa peristaltik untuk menggerakkan fluida
Column chromatography
kromatografi kolom adalah contoh peralatan low-performance liquid chromatography

Solvent reservoir

Column head
Column

Column packing

Porous glass plate

• Sampel biasanya dimasukkan secara langsung ke bagian atas kolom

• Tiap fraksi ditampung secara terpisah, kemudian dianalisis secara terpisah
Low-performance liquid chromatography

Kelebihan
– peralatan yang sederhana
– low cost
– umum digunakan untuk menghilangkan pengotor/memurnikan sampel
– aplikasi analitik bersifat terbatas (efisiensi rendah, waktu analisis lama, dst)
High-performance liquid chromatography (HPLC)

• Metode LC yang mempergunakan fasa diam

berukuran kecil, seragam, dan rigid
• diameter partikel <40 μm
• biasanya berkisar 3-10 μ m

• Efisiensi sistem yang baik

• Nilai HETP yang kecil
• Karakteristik:
• puncak yang sempit
• limit deteksi yang rendah
• waktu pemisahan singkat
• kolom dapat dioperasikan di tekanan dan
laju alir yang relatif tinggi
Tipikal sistem HPLC sederhana
High-performance vs Low-performance LC

Keuntungan
• Waktu analisis yang singkat
• Kemudahan untuk diautomatisasi
• Limit deteksi yang rendah (baik)
• Sesuai untuk keperluan analitik

Kekurangan
• Relatif lebih mahal
• Kapasitas sampel lebih kecil
C.) Elusi
• Retensi dan elusi sampel pada LC bergantung pada interaksi sampel dengan fasa gerak
DAN fasa diam.
• Untuk menggambarkan seberapa baik sampel teretensi pada kolom dengan berbagai jenis
pelarut (fasa gerak), dipergunakan istilah weak mobile phase dan strong mobile phase.

Strong mobile phase

• Pelarut yang dapat mengelusi sampel dari kolom dalam waktu yang singkat
• Terjadi apabila interaksi antarmolekul fasa gerak dan fasa diam terhadap sampel memiliki
kemiripan yang sangat tinggi
• Pelarut polar akan menjadi fasa gerak yang kuat (strong mobile phase) jika dipergunakan pada
kolom berisi fasa diam polar.

Elusi berlangsung sangat singkat

untuk semua komponen pada sampel
Weak mobile phase
• Pelarut yang dapat mengelusi sampel dari kolom dalam waktu yang lama
• Terjadi apabila interaksi antarmolekul fasa gerak dan fasa diam terhadap sampel
sangat berlainan
• Pelarut non-polar akan menjadi fasa gerak yang lemah (weak mobile phase) jika
dipergunakan pada kolom berisi fasa diam polar.

Elusi yang lambat (~ 20 menit) untuk

semua komponen pada sampel

Catatan: kuat atau lemahnya suatu suatu fasa gerak

bergantung pada jenis fasa diam yang dipergunakan
Sama dengan GC, proses elusi pada LC dapat dilakukan pada kondisi konstan
ataupun kondisi yang berubah (gradient elution)

Isocratic elution: penggunaan fasa gerak dengan komposisi tetap

• sederhana dan tidak mahal
• sukar mengelusi seluruh komponen dengan resolusi yang baik dan waktu yg
optimal (masalah umum elusi)

Diperlukan komposisi pelarut yang

tepat untuk mendapatkan pemisahan
yang optimal
Gradient elution
mengubah kompisisi fasa gerak sebagai fungsi dari waktu (solvent programming)
• Dimulai dari weak mobile phase ke strong mobile phase
• weak mobile phase  pelarut A
• strong mobile phase  pelarut B
• perubahan pelarut dapat bertahap, linear, atau non-linear
% pelarut B

waktu
Teknik gradient elution
untuk campuran 30 asam
amino

Faktor-faktor yang mempengaruhi pemilihan fasa gerak pada LC:

• Tipe fasa diam yang dipergunakan
• Kelarutan sampel
• Viskositas fasa gerak
• Tipe detektor dan sinyal background pelarut
• Kemurnian pelarut
• Kelarutan beberapa pelarut (gradient elution)
Pemilihan fasa gerak pada LC dapat dilakukan dengan
mempertimbangkan kepolaran pelarut dan sampel

Refractiv Viscosity Boiling Polarity Eluent

Solvent e Index (cP) Point (oC) Index (P) Strength (eo)
Fluoroalkanes 1.27-1.29 0.4-2.6 50-174 <-2 -0.25
cyclohexane 1.423 0.90 81 0.04 -0.2
N-hexane 1.327 0.30 69 0.1 0.01
1-chlorobutane 1.400 0.42 78 1.0 0.26
Carbon tetrachloride 1.457 0.90 77 1.6 0.18
i-propyl ether 1.365 0.38 68 2.4 0.28
toluene 1.494 0.55 110 2.4 0.29
Diethyl ether 1.350 0.24 35 2.8 0.38
tetrahydrofuran 1.405 0.46 66 4.0 0.57
chloroform 1.443 0.53 61 4.1 0.40
ethanol 1.359 1.08 78 4.3 0.88
Ethyl acetate 1.370 0.43 77 4.4 0.58
dioxane 1.420 1.2 101 4.8 0.56
methanol 1.326 0.54 65 5.1 0.95
acetonitrile 1.341 0.34 82 5.8 0.65
nitromethane 1.380 0.61 101 6.0 0.64
Ethylene glycol 1.431 16.5 182 6.9 1.11
water 1.333 0.89 100 10.2 large
D.) Tipe-tipe Liquid Chromatography:

Teknik LC diklasifikasikan berdasarkan mekanisme pemisahan yang berlangsung

E.) Detektor LC

Jenis detektor LC yang umum

• Refractive Index Detector
Pemilihan detektor bergantung pada jenis
• Conductivity Detector
sampel, tujuan (analisis atau preparatif), dst
• UV/Vis Absorbance Detector
• Electrochemical Detector
• Fluorescence Detector

Detector Selectivity Sensitivity Notes

Refractive Index Poor Poor Any component that differs in refractive index from
the eluate can be detected, despite its low sensitivity.
Cannot be used to perform gradient analysis.
UV/Vis Moderate Good A wide variety of substances can be detected that
absorb light from 190 to 900 nm. Sensitivity depends
strongly on the component.
Fluorescence Good Excellent Components emitting fluorescence can be detected
selectively with high sensitivity. This is often used for
pre-column and post-column derivatization.
Conductivity Moderate Good Ionized components are detected. This detector is
used mainly for ion chromatography.
Electrochemical Good Excellent Electric currents are detected that are generated by
electric oxidation-reduction reactions. Electrically
active components are detected with high sensitivity.
Asam Amino pada Sampel Ekstrak Apel