HPLC (Perfomance Liquid

Chromatography)
Kelompok 1 :
M. Halim Satria (1501027)
Annisa Muthmainah (1701005)
Dhea Ananda Fitri (1701011)
Intan Sri Maulina (1701019)
Mai Syarah Ardilla (1701024)
Nurul Farida (1701031)
Sonia Husna (1701037)
Wulan Desmar Utari (1701044)
Pengertian HPLC (Perfomance Liquid
Chromatography)
• Kromatografi Cair Kinerja Tinggi atau KCKT atau biasa
juga disebut dengan HPLC (Hight Performance Liquid
Chromatograhy ) dikembangkan pada akhir tahun
1960-an dan awal tahun 1970-an.
• High performance liquid chromatography (HPLC)
adalah suatu alat teknologi kimia modern yang
digunakan untuk menentukan komponen dalam suatu
sampel dengan metode pememisahkan komponen
berdasarkan interaksi antara fase gerak dan fase diam
(McMaster 2007).
• HPLC yaitu Kromatografi cair berperforma tinggi (high
performance liquid chromatography) merupakan salah
satu teknik kromatografi untuk zat cair yang biasanya
disertai dengan tekanan tinggi.
• Prinsip Dasar
Prinsip dasar dari HPLC adalah pemisahan analit-
analit berdasarkan kepolarannya.

• Prinsip Kerja HPLC

Prinsip dari HPLC adalah pemisahan suatu
komponen dengan adanya interaksi antara fase
diam (cairan) yang bersifat polar dan fase gerak
(eluen) yang bersifat non polar. Proses pemisahan
ini berdasarkan distribusi antara fase diam dan
fase gerak yang terjadi pada kolom utama.
Kegunaan dari HPLC :
• HPLC dengan prinsip kromatografi banyak
digunakan pada industri farmasi dan pestisida.
• Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara
sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan
dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.
• Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan
kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan
kolom butiran berlapis zat berpori.
• Dapat digunakan untuk memurnikan dan
mengidentifikasi suatu senyawa.
JENIS HPLC
• Kromatografi Adsorbsi
• Kromatografi Fase Terikat
• Kromatografi Penukar Ion
• Kromatografi Pasangan Ion
• Kromatografi Eksklusi Ukuran
• Kromatografi Afinitas
Kromatografi Adsorbsi
• Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya
menggunakan fase normal dengan
menggunakan fase diam silika gel dan alumina,
meskipun demikian sekitar 90% kromatografi
ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada
silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang
akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol
pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda,
karenanya solut dapat terikat secara kuat
sehingga dapat menyebabkan puncak yang
berekor.
Kromatografi fase terikat
(Kromatografi Partisi)
• Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah
silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase
terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk
memodifikasi silika adalah hidrokarbon-
hidrokarbon non-polar seperti dengan
oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil.
Fase diam yang paling populer digunakan
adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan
kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.
Kromatografi Penukar Ion

• HPLC penukar ion menggunakan fase diam yang

dapat menukar kation atau anion dengan suatu
fase gerak. Ada banyak penukar ion yang
beredar di pasaran, meskipun demikian yang
paling luas penggunaannya adalah polistiren
resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion
dilakukan dengan menggunakan media air
karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal
digunakan pelarut campuran misalnya air-
alkohol dan juga pelarut organik.
Kromatografi Pasangan ion

• Kromatografi pasangan ion juga dapat

digunakan untuk pemisahan sampel-sampel
ionik dan mengatasi masalah-masalah yang
melekat pada metode penukaran ion.
Kromatografi Eksklusi Ukuran
• Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi
permiasi gel dan dapat digunakan untuk
memisahkan atau menganalisis senyawa dengan
berat molekul > 2000 dalton. Fase diam yang
digunakan dapat berupa silika atau polimer yang
bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus
(lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase
diam.
• Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih
besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian
molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir
adalah molekul yang jauh lebih kecil.
Kromatografi Afinitas
• Pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi
biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam
mengandung gugus-gugus molekul yang hanya
dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi
yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu
pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam
interaksi antara antigen dan antibodi).
Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk
mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang
sangat kompleks.
Bagian-bagian dan Fungsinya
Metode Pemisahan Umum dalam HPLC:
Tergantung sifat polaritas senyawa dalam eluen

• FasaNormal:
Fasa gerak nonpolar
Fasa diam polar
 Fase diam yang digunakan seperti silica, alumina, atau
trietilenaglikol yang dilapiskan pada partikel silica. Sedangkan
fase gerak yang digunakan adalah heksana atau i-propileter.

• Fasa Terbalik:
Fasa gerak polar
Fasa diam nonpolar
 Fase gerak yang digunakan seperti air, methanol, atau asetinitril.
Kerja HPLC
Pada proses kualitatif cara yang paling umum
untuk mengidentifikasi adalah dengan melihat
Retention time (RT).
• Peak yang mempunyai RT yang sama dengan
standard umumnya adalah sebagai peak milik
analat.
• Selain melihat RT hal lain yang perlu dilihat
adalah spektrum 3D dari signal kromatogram.
Sehingga jika spektrum 3D antara dua zat
berbeda, maka kedua zat tersebut juga
dipastikan adalah zat yang berlainan, meskipun
memiliki RT yang sama.
Kemudian melalui analisa kuantitatif dapat
diketahui kadar komponen yang dianalisis di dalam
sampel.
• Yang berperan dalam proses separasi pada system
HPLC adalah kolom. Kolom merupakan
bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk
berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.
• Setelah komponen dalam sample berhasil
dipisahkan, tahap selanjutnya adalah proses
identifikasi. Hasil analisa HPLC diperoleh dalam
bentuk signal kromatogram. Dalam kromatogram
akan terdapat peak-peak yang menggambarkan
banyaknya jenis komponen dalam sample.
Kelebihan Dalam Penggunaan HPLC
• Mampu memisahkan molekul- molekul dari suatu campuran
• Mudah melaksanakannya
• Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi
• Kolom dapat digunakan kembali
• Mudah melakukan "sample recovery". Mudah untuk
mendapatkan kembali cuplikan, karena detector pada HPLC
tidak merusak komponen zat yang dianalisis.
• Dapat menganalisis senyawa organik yang terurai (labil)
pada suhu tinggi karena HPLC dilakukan pada suhu kamar.
• Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan
rasa diam dan rasa gerak pada HPLC memberikan
parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang
diinginkan.
Kekurangan Dalam Penggunaan HPLC

• Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu

• Hanya bisa digunakan untuk asam organic
• Harus mengetahui kombinasi yang optimum
antara pelarut, analit, dan gradient elusi
• Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam
lingkup penelitian yang terbatas
Diagram Alir
 JURNAL ANALISIS INSTRUMEN PENETAPAN KADAR THIAMIN
PADA TABLET VITAMIN B1 DENGAN HPLC
Megaputri, Michelle Ferdinand, Muhamad Ariq Alwan Winata, Muhammad
Andika Aryana, Muhammad Fajar Ismail

Thiamindilarutkan dalam larutan buffer pospat pH 4,5. Pemisahan

terhadap thiamin dilakukan dengan menginjeksikan larutan contoh pada sistem
KCKT menggunakan kolom fase terikat C18 fase gerak campuran bufferb pospat :
methanol (55:45) secara isokratik dengan kecepatan air 0,5 mL/menit. Detektor
yang digunakan adalah UV-Vis pada panjang gelombang 254nm. Dengan
membandingkan luas area sampel dan standar maka konsentrasi thiamin dapat
diketahui.
Material dan bahan yang dibutuhkan dalam penetapan ini adalah Corong,
Labu ukur 100 mL, Labu ukur 50 mL, Pialagelas 800 ml, Pialagelas 400 mL, Pipet
tetes, Pipet colum 5 mL, Pipet serologi, Kertas saring Whatman No.41, dan
penyaring milipore 0.22 μm. Sistem Kromatografi Cair Kinerja Tinggi, Agilent 100,
Detektor UV 254 nm, fase gerak methanol : buffer fosfat (45:55), 0,5mL/menit.

Pereaksi yang digunakan :

a. Buffer fosfat pH 4,5
b. Larutan standard induk Thiamin 1000 ppm
c. Larutan standard Thiamin 30 ppm
PROSEDUR KERJA :
• Persiapan standar
Pembuatan larutan induk Thiamin 1000 ppm Ditimbang
0,1000 gram Thiamin HCl dan dilarutkan dengan buffer fosfat
dalam labu ukur 100 mL, dihimpitkan dan dihomogenkan.
1. Larutan standar 100ppm
Standar induk thiamin HCl 1000 ppm dipipet 10 ml dan
dimasukkan kedalam labu ukur 10 mL dan ditambahkan
larutan buffer pospat pH 4,5 lalu dihimpitkan dan
dihomogenkan dan disaring dengan kertas saring milliporre.
2. Persiapan Sampel
Ditimbang 5 tablet vitamin B1, lalu 2 tablet dihaluskan.
Ditimbang 0,2000 gram vitamin B1 yang sudah halus,
dimasukkan ke dalam labu ukur 100ml dan ditambahkan
larutan buffer pospat, dikocok selama 5 menit, dan disaring
dengan kertas saring no.41. kemudian dipipet 5 ml filtrat,
dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml, disaring dengan kertas
saring milipore, dan siap diinjeksikan.