Reversed Phase

Chromatography
Kelompok 2
Anggota Kelompok 2

1. Kaspila Sari Putri H031201045

2. Afifah Nur Falah Madani Pertiwi H031201050
3. Andi Muhammad Iskar Ismail H031201051
4. Irnadia Zahrawani H031201060
5. Nanda Aulia Pratiwi H031201068
6. Aulia Rahma H031201080
7. Silvya Kasri Ramadhani H031201084
 Definisi Kromatografi Menurut IUPAC
• Kromatografi adalah metode pemisahan senyawa dimana komponen-
komponen yang Akan dipisahkan didistribusi antara dua fasa, yaitu fasa diam
dan fasa gerak.
• Dalam HPLC, fasa diam adalah bahan padat, berpori, permukaan aktif dalam
bentuk partikel kecil, ataupun cairan yang dilapisi butiran mikro partikulat
dari zat padat (biasanya silika).
• Adapun fasa gerak adalah cairan yang bergerak melalui fasa diam di dalam
kolom membawa analit dan bersifat inert.
 01
PENGERTIAN
reversed-phase chromatography
 Kromatografi fasa terbalik atau reversed-phase chromatography
atau kromatografi hidrofobik adalah metode kromatografi yang
menggunakan fasa diam hidrofobik. Kromatografi fasa terbalik adalah
teknik pemisahan yang umum digunakan, dimana molekul dipisahkan
berdasarkan polaritas.
 02
PRINSIP KERJA
reversed-phase chromatography
 Reverse Phase Normal Phase

Fasa diam → Nonpolar Fasa diam → Polar

Fasa gerak → Polar Fasa gerak → Nonpolar

• Kromatografi fasa terbalik adalah salah satu teknik pemisahan senyawa di mana
fasa gerak yang digunakan lebih polar dari pada fase diam.
• Fasa diam yang paling sering digunakan adalah octadecylsilane (ODS).
Prinsipnya berdasarkan interaksi hidrofobik. Molekul hidrofobik terabsorbsi pada
fase diam yang nonpolar dengan fase gerak polar.
• Air sering digunakan sebagai media elusi terbaik dalam sistem kromatografi,
tetapi pada kromatografi fase terbalik, air tidak dapat berinteraksi dengan
molekul hidrofobik sehingga fase gerak akan memberikan laju elusi sampel
yang lama.
• Semakin hidrofobik suatu molekul, semakin lama tertahan pada fasa diam, dan
semakin tinggi konsentrasi pelarut organik yang diperlukan untuk mengelusi
molekul tersebut.
 Fasa Gerak
• Fase gerak dalam kromatografi fase
terbalik umumnya terdiri dari campuran
Methanol
air atau larutan buffer dengan berbagai
Acetonitrile
pelarut organik yang larut dalam air.
Ethanol Isopropanol • Polaritas
• Adanya pelarut organik yang berkurang
Dimethylformamide • Kekuatan
ditambahkan ke fase gerak, maka waktu
Propan-1-ol elusi
retensi analit akan terus berkurang. meningkat
Dioxane
• Fase gerak yang memiliki viskositas
Tetrahydrofuran
rendah dapat mengurangi dispersi dan
menjaga tekanan sistem tetap rendah.
 Fasa Diam
• Fasa diam nonpolar (berupa hidrofobik)
• Segala bahan nonpolar inert yang dapat memenuhi syarat pengemasan
dapat digunakan dalam kromatografi fasa terbalik. Kolom paling populer
adalah rantai karbon oktadesil (C18) yang terikat pada silika.
• Waktu retensi akan semakin lama jika terdapat ikatan C yang lebih banyak
pada fasa diam.
• Fasa diam juga dipengaruhi oleh densitas ikatan pada rantai alkil,
ketebalan fasa diam (lapisan polimerik lebih retentive dari monomerik)
 03
PENGAPLIKASIAN
reversed-phase chromatography
Tujuan: Sebuah metode RP-HPLC yang sederhana, sensitif, cepat, tepat dan
akurat telah dikembangkan untuk estimasi simultan Hydroquinone,
Hydrocortisone dan Tretenoin dari Formulasi Krim.
ALAT
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah HPLC Cyber Lab dengan Inertsil
C18 (4, mm x 250 mm, 5 µm) dan Spektrofotometer UV-Vis.

BAHAN
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel, asetonitril, metanol,
dan akuades.

PROSEDUR KERJA
➢ Kondisi Kromatografi
Larutan standar hidrokuinon, hidrokortison, dan tretinoin diinjeksi ke dalam
kolom sebanyak 20 µL menggunakan mikrosyringe. Kromatogram dijalankan selama
beberapa menit dengan fase gerak larutan penyangga 0,05 M potassium dihydrogen
orto fosfat (pH 4) dan methanol dalam perbandingan 80:20 %V/V. Kromatogram
dihentikan setelah pemisahan dicapai secara sempurna. Data yang dihasilkan direkam
menggunakan software.
➢ Perhitungan Statistic
Deviasi standar dan parameter statistic yang lain ditampilkan menggunakan
software Microsoft excel 2007.

➢ Persiapan Fase Gerak

Pelarut kelas HPLC digunakan dalam botol pompa gradien terpisah sebagai
fase gerak. Campuran Buffer dan metanol dengan perbandingan 80:20% v/v
disesuaikan dengan pompa gradien yang dioperasikan oleh perangkat lunak solusi LC.
Pelarut campuran disaring melalui filter membrane nilon 0,45µm dan dihilangkan
gasnya oleh instrumen dan digunakan sebagai fase gerak.
➢ Persiapan Penyangga
Diambil sekitar 6,8 gram reagen kalium dihidrogen orto fosfat ke dalam gelas
kimia 1000 mL. Kemudian ditambahkan 800 mL air dan dilarutkan. Setelah itu,
disesuaikan pH 4,0 larutan ini dengan Asam Ortofosfat 1%. Lalu dibuat volume hingga
1000 mL dengan air dan digunakan larutan ini sebagai buffer.

➢ Preparasi Larutan Standar

Ditimbang hidrokuinon, hidrokortison, dan tretinoin masing-masing
sebanyak 40 mg, 80 mg, dan 5 mg. lalu dilarutkan ke dalam 100 mL methanol.
➢ Preparasi Sampel
Ditimbang krim sebanyak 4 g ke dalam labu ukur 100 mL. ditambahkan
60 mL methanol, lalu labu ukur ditaruh pada water bath pada suhu 60 oC selama
15 menit. Lalu, dihimpitkan dengan methanol. Disaring larutan menggunakan
kertas saring Whatman no. 41.

➢ Penentuan Panjang Gelombang Maksimum

Larutan standar hidrokuinon, hidrokortison, dan tretinoin dianalisis
pada rentang 200 – 400 nm dan spektrum UV direkam.
 HPLC Cyber Lab (Model: Cyber Lab 1600 EX) dengan Inertsil C18 (ID 4,6
mm × 250 mm, 5 µm) Kolom digunakan untuk Pemisahan Kromatografi. Larutan
standar Hydroquinone, Hydrocortisone dan Tretenoin disuntikkan ke dalam kolom
dengan jarum suntik mikro 20 µL. Kromatogram dijalankan selama beberapa
menit dengan fase gerak Penyangga 0,05 M kalium dihidrogen orto fosfat (pH 4,0)
dan Metanol dalam perbandingan 80:20 %V/V pada laju alir 1 mL/menit dan
deteksi UV pada ÿmaks 265 nm.
Kromatogram dihentikan setelah pemisahan tercapai sepenuhnya. Data
yang terkait dengan puncak seperti luas, tinggi, waktu retensi, resolusi, dll
direkam menggunakan perangkat lunak. Kromatogram tipikal pemisahan
Hydroquinone, Hydrocortisone dan Tretenoin ditunjukkan pada Gambar dan
semua kondisi kromatografi ditunjukkan pada Tabel 1.
Pengembangan Metode HPLC dan Optimasi Fase Gerak

Hidrokuinon, Hydrocortisone dan Tretenoin adalah bentuk sediaan krim

kombinasi yang digunakan sebagai melasma dan anti jerawat. Analisis ini
difokuskan pada optimalisasi kondisi untuk analisis sederhana dan cepat serta
biaya rendah menambahkan pemilihan kolom dan fase gerak yang tepat. Jenis
pelarut, kekuatan pelarut, panjang gelombang deteksi dan laju alir divariasikan
untuk menentukan kondisi kromatografi yang memberikan pemisahan terbaik.
Kondisi fase gerak dioptimalkan sehingga tidak ada gangguan dari pelarut dan
eksipien.
Karena obat (krim) ini larut dalam pelarut polar seperti metanol dan buffer,
Metode RP-HPLC dianggap cocok. Awalnya fase gerak yang berbeda telah
dicoba. Akhrinya resolusi yang dapat diterima dengan bentuk puncak yang wajar
dan kemurnian puncak yang tinggi dicapai dengan menggunakan campuran
Buffer 0,05M Potassium Di hydrogen Ortho Phosphate (pH 4,0) dan Metanol
dalam perbandingan 80:20% V/V pada 265 nm.

Metode yang disarankan berhasil diterapkan untuk penentuan Hydroquinone,

Hydrocortisone dan Tretenoin formulasi krim di dalam farmasinya. Hasilnya,
ditunjukkan memuaskan dan sesuai dengan jumlah yang tertera pada label. Karena
tidak ada metode analitik (referensi) yang tersedia untuk pengujian campuran
rangkap tiga ini.
Kesimpulan

Hasil penelitian menunjukkan bahwa Metode RP- HPLC yang diusulkan sederhana,
cepat, tepat danakurat. Metode ini dikembangkan dan divalidasi untuk analisis
rutin Hydroquinone, Hydrocortisone dan Tretenoin dalam formulasi topikal krim.
Hasilnya mengungkapkan bahwa metode yang diusulkan bisa berhasil diterapkan
untuk analisis rutin dan kontrol kualitas bentuk sediaan farmasi yang mengandung
Hydroquinone, Hydrocortisone dan Tretenoin. Kondisi fase gerak dioptimalkan
sehingga tidak ada gangguan dari pelarut dan eksipien. Fase gerak yang
mengandung Buffer 0,05M potassium dihydrogen ortho phosphate (pH 4.0)-
Methanol dengan perbandingan 80:20% V/V.
 DAFTAR PUSTAKA

Shilu, R., Kapupara, P., dan Patel, M., 2021, A Stability Indicating Reverse Phase High
Performance Liguid Chromatography Method for Simultaneous Estimation
of Hydroquinone, Hydrocortisone and Tretenoin in Cream Formulation,
Journal of Pharmaceutical Research International, 33(39B): 67-78.
 04
KEUNTUNGAN &
KERUGIAN
reversed-phase chromatography
 Keuntungan
Metode ekonomis dibandingkan dengan
teknik kromatografi lainnya.
RP-HPLC memungkinkan air untuk
digunakan dalam komposisi fase gerak
dengan pelarut lain.
Memberikan hasil yang akurat dengan
jumlah sampel yang sedikit.
Kromatografi RP juga memiliki
keuntungan karena dapat menggunakan
selektivitas pH untuk meningkatkan
pemisahan.
Fase diam hidrofobik dalam kolom fase
terbalik bekerja dengan baik untuk
retensi sebagian besar molekul organik.
Dapat menggunakan selektivitas pH
untuk mendapatkan pemisahan yang
lebih baik.
Sekitar 75 persen dari semua metode
HPLC menggunakan kromatografi fase
terbalik.
 Kerugian

Membutuhkan
Senyawa yang Dalam RP-HPLC perlu kemampuan teknis
tidak larut dalam menciptakan tekanan dan keterampilan
air bisa lebih sulit untuk menangani
dianalisis sistem

Silika kolom fase Sampel yang dielusi dari

terbalik dapat kolom tidak dapat
dilarutkan pada diperoleh kembali
pH > ~ 7,5
Thank You☺