FITOKIMIA

KROMATOGRAFI KOLOM
Disusun Oleh : Syifa Rizki Azzahra
(31121194)
 Definisi

Kromatografi kolom adalah metode yang digunakan

untuk memurnikan bahan kimia tunggal dari
campurannya baik dalam keadaan fasa cair maupun
padat untuk menghasilkan senyawa yang diinginkan
secara individu.
Pemisahan kromatografi kolom didasarkan pada
perbedaan interaksi setiap senyawa yang ingin
dipisahkan dengan media kromatografi kolom yang
digunakan
 Prinsip Kromatografi Kolom

Prinsip kerja: Memisahkan komponen campuran berdasarkan

perbedaan interaksinya dalam fasa diam dan fasa gerak. Jika
suatu campuran terdiri dari beberapa komponen, maka setiap
komponen tersebut memiliki struktur masing masing dengan sifat
khas untuk setiap senyawa. Kepolaran senyawa, berat ukuran
molekul, ukuran dan berat komponen yang dipisahkan
merupakan faktor berpengaruh dalam pemisahan kromatografi
kolom.
 FASE DIAM

Berupa adsorben yang tidak boleh larut dalam fasa

gerak. Ukuran partikel fasa diam harus seragam
Contoh: Silica gel, arang, bauksit, magnesium karbonat,
talk, pati dan selulosa
 FASE GERAK

Pemilihan fase gerak (pelarut = solven = eluen) sangat menentukan berhasil

tidaknya pemisahan. Untuk menentukan fase gerak yang akan digunakan,
dilakukan pendekatan yaitu penelurusuran literature atau berdasarkan hasil
pemantauan KLT. Cara ini dikerjakan dengan memilih fase diam KLT sejenis dengan
fase diam kolom yang akan digunakan. Biasanya dicoba dikembangkan dengan
fase gerak non polar kemudian diikuti dengan fase gerak yang lebih polar
 ELUEN

Fase gerak dimasukan kedalam kolom dengan cara dituangkan sedikit

demi sedikit atau dialirkan dari bejana yang diletakan diatas kolom
sehingga fase gerak mengalir dengan sendirinya.
PERINGATAN:
Pelarut yang mampu menjalankan elusi terlalu cepat tidak akan mampu
mengadakan pemisahan yang sempurna. Elusi yang terlalu lambat akan
menyebabkan waktu retensi terlalu lama
Jenis-jenis dan prinsip
kerja
 Preparasi Sampel

• Perbandingan berat sampel dan fase gerak (1:30) dengan

perbandingan dapat ditingkatkan hingga (1:50) untuk komponen yang
susah dipisahkan
• Sampel dihomogenkan dengan fase diam sehingga merupakan serbuk
kering, diatas lapisan ini dapat diletakkan pasir untuk menjaga tidak
terjadinya kerusakan waktu ditambahkan fase gerak diatas lapisan
sampel
 APLIKASI KROMATOGRAFI KOLOM
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA FLAVONOID EKSTRAK ETANOL PANDAN
REVIEW JURNAL
Monografi Tanaman
Salah satu jenis tanaman yang ada di Kalimantan

Barat diantaranya merupakan tanaman yang berasal

dari genus Freycinetia yakni tanaman pandan hutan

jenis baru (Freycinetia sessiliflora Rizki.) yang

ditemukan di Gunung Passi, Singkawang dan

keberadaanya masih belum terekspos secara luas

dan belum banyak diteliti.

 Metode
Alat
Alat yang digunakan seperangkat alat gelas, wadah maserasi, plat
kromatografi lapis tipis (KLT), lampu UV penampak bercak 254 nm dan
366 nm, neraca analitik, alat kromatografi kolom, chamber, pipa
kapiler, rotary evaporator, kertas saring.
Bahan
yang digunakan pandan jenis baru (Freycinetia sessiliflora Rizki),
etanol 96%, larutan asam klorida (HCl), serbuk magnesium (Mg),
larutan natrium hidroksida (NaOH) 10%, asam sulfat (H2SO4) pekat,
silika gel 60, nbutanol, asam asetat glasial, quersetin, Aquadest
 Eluen

Eluen yang dipakai dalam KLT ialah campuran n-butanol : asam asetat
: air ( 4: 1 :5 ) yang mampu memberikan pemisahan.

Eluen yang baik ialah eluen yng bisa memisahkan senyawa dalam
jumlah yang banyak yang di tandai denga munculnya noda
 Prosedur ekstraksi

Sejumlah sampel dimasukkan kedalam bejana maserasi dibiarkan

cairan penyari merendam seluruh serbuk simplisia sambil sesekali
diaduk, kemudian disaring untuk mengambil filtratnya. Filtrat diuapkan
dengan rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental etanol
ekstrak etanol pandan jenis baru Freycinetia sessiliflora Rizki.
 Prosedur Kromatografi Kolom
Ekstrak dilarutkan dengan sedikit pelarutnya kemudian dimasukkan
dalam yang telah disiapkan, fase gerak ditambahkan secara terus
menerus sampai terjadi pemisahan. Eluat ditampung pada penampung
fraksi setiap 3 mL. Eluat yang diperoleh dilihat pola nodanya pada KLT.
Data yang diperoleh dianalisis secara deskriptif meliputi identifikasi
dengan penambahan reagen sebanyak 3 kali replikasi, ditandai dengan
perubahan warna yang dihasilkan. Ekstrak yang positif mengandung
golongan senyawa aktif dilanjutkan dengan kromatografi lapis tipis
(KLT) dan kromatografi kolom dengan eluen yang sesuai.
HASIL PENELITIAN

• Hasil skrining Fitokimia flavonoid

menunjukkan bahwa ekstrak etanol Pandan

Species Baru Freycinetia sessiliflora Rizki

mengandung flavonoid pada uji NaOH 10%

dan uji H2SO4.

HASIL PENELITIAN

• Pemisahn komponen sampel dengan

kromatografi kolom menghasilkan 16 eluat

yang ditampung dalam vial. eluat hasil

kromatografi kolom dilihat pola nodanya

menggunakan KLT dengan fase gerak BAA

(4:1:5).
 KESIMPULAN

• Berdasarkan penelitian Mustapa, A dkk (2019) yang

• Ekstrak etanol Pandan
menyatakan bahwa nilai Rf pembanding kuersetin yang
Species Baru Freycinetia
digunakan sebagai pembanding memiliki range nilai Rf 0,69-
sessiliflora Rizkimengandung
0,817. Rf senyawa flavonoid ekstrak etanol pandan yaitu
flavonoid.
0,72-0,78 dengan bercak noda berwarna kuning kecoklatan.

Nilai Rf dapat dijadikan bukti dalam mengidentifikasi suatu

senyawa. Senyawa senyawa dengan nilai Rf yang sama atau

hampir sama dapat menunjukkan bahwa senyawa tersebut

memiliki karakteristik yang sama atau mirip
KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS
Cara pemisahan campuran senyawa menjadi senyawa murninya dan mengetahui
kuantitansnya yang digunakan

KLT digunakan untuk :

1. Memisahkan senyawa senyawa yang sifatnya hidrofobik seperti lipida-lipida
dan hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas
2. Memisahkan substansi campuran menjadi komponen-komponennya
 Penggunaan KLT

Tujuannya untuk
1. Menentukan banyaknya komponen dalam campuran
2. Identifikasi senyawa,
3. Memantau berjalannya suatu reaksi
4. Menentukan efektivitas pemurnian
5. Menentukan dan memantau kondisi yang sesuai untuk kromatografi
kolom
6. Melakukan screening sampel untuk obat
 KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS PREPARATIF

Kromatografi lapis tipis preparatif merupakan prosesisolasi yang terjadi

berdasarkan perbedaan daya serapdan daya partisi serta kelarutan dari
komponen-komponen kimia yang akan bergerak mengikuti kepolaran eluen
oleh karena daya serap adsorben terhadap komponen kimia tidak sama, maka
komponen bergerak dengan kecepatan yang berbeda sehingga hal inilah yang
menyebabkan pemisahan
APLIKASI KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS PREPARATIF
 Metode

Bahan-bahan yang digunakan adalah kulit Durio zibethinus Murr., etanol 96% teknis,

aquades, asam klorida, anhidrida asam asetat, asam sulfat, pereaksi Meyer, pereaksi

Dragendorff, pereaksi LiebermannBurchard, serbuk Mg, amil alkohol, eter, amonia, larutan

feri klorida, etanol p.a dan teknis, n-heksana p.a dan teknis, kloroform p.a dan teknis, etil

asetat p.a dan teknis metanol p.a dan teknis, silika gel 60 GF254, KLT aluminium 20x20 cm,

KLT preparatif (5x20 cm dan 20x20 cm), kertas saring, bakteri Escherichia coli, bakteri

Staphylococcus aureus, jamur Candida albicans, media NA (Nutrien Agar), media PDA

(Potato Dextrose Agar), larutan NaCl 0,9 %, kertas cakram, tetrasiklin, ketokonazol, DMSO.
 Alat

alat gelas standar penelitian, mortar porselin, pipet mikro, cawan porselin, chamber KLT,

botol vial, rotary evaporator, neraca analitis, erlenmeyer, kurs porselin, vakum, kolom,

tabung reaksi, cawan penguap, jarum ose, inkubator, autoklaf, spreader, cawan petri,

spektrofotometer UV dan spektrofotometer FTIR.

 Proses ekstraksi

Ekstraksi dan Fraksinasi

Proses ekstraksi dilakukan dengan menggunakan metode maserasi. Kulit Durio zibethinus

dimaserasi dengan pelarut etanol sampai bening dengan penggantian pelarut selama 24

jam. Filtrat yang diperoleh dipekatkan dengan menggunakan rotary evaporator sehingga

didapatkan ekstrak kental etanol. Ekstrak kental etanol yang diperoleh kemudian dilakukan

fraksinasi berturut-turut dengan pelarut nheksana, kloroform, etil asetat, dan metanol

dengan menggunakan kromatografi cair vakum dengan fase diam silika gel. Filtrat yang

diperoleh dari masingmasing pelarut kemudian dipekatkan menggunakan rotary

evaporator sehingga didapatkan fraksi kental nheksana, kloroform, etil asetat, dan

metanol.
 Proses ekstraksi

Ekstraksi dan Fraksinasi

Proses ekstraksi dilakukan dengan menggunakan metode maserasi. Kulit Durio zibethinus

dimaserasi dengan pelarut etanol sampai bening dengan penggantian pelarut selama 24

jam. Filtrat yang diperoleh dipekatkan dengan menggunakan rotary evaporator sehingga

didapatkan ekstrak kental etanol. Ekstrak kental etanol yang diperoleh kemudian dilakukan

fraksinasi berturut-turut dengan pelarut nheksana, kloroform, etil asetat, dan metanol

dengan menggunakan kromatografi cair vakum dengan fase diam silika gel. Filtrat yang

diperoleh dari masingmasing pelarut kemudian dipekatkan menggunakan rotary

evaporator sehingga didapatkan fraksi kental nheksana, kloroform, etil asetat, dan

metanol.
 Preparasi sampel

Kulit durian bagian dalam diambil dari bagian luar, kemudian dibersihkan dan dicuci,

kemudian dikeringkan pada suhu kamar. Pemotongan menjadi ukuran lebih kecil
dikarenakan untuk memperluas permukaan sehingga membantu pelarut untuk

mengekstraksi secara maksimal senyawa-senyawa yang terdapat dalam kulit durian.

Pengeringan tidak di bawah

 HASIL

Hasil dari penapisan fitokimia menunjukkan bahwa

serbuk kulit durian mengandung saponin, flavonoid,

tanin, kuinon, dan steroid/triterpenoid sedangkan

ekstrak etanol kulit durian mengandung saponin,

flavonoid, tanin, kuinon, steroid/triterpenoid, dan

alkaloid.
 HASIL

• Fase diam silika gel GF254 dan fase • Profil KLT preparatif pita E.2.2 diamati

gerak etil asetat : n-heksana (6:4). dalam lampu UV254.

 HASIL

• Hasil KLT preparatif fraksi E.2 dengan fase diam

silika gel GF254 dan fase gerak etil asetat : nheksana

(6 : 4)
Hasil Dengan Penampak Bercak

• Penampak bercak E.2.2.2 dengan fase diam

silika gel GF254 dan fase gerak etil asetat : n-

heksana (6:4) diamati dalam lampu UV365 (a)

isolat E.2.2.2 sebelum diuapi amonia (b) isolat

E.2.2.2 setelah diuapi amonia

HASIL FTIR
 HASIL FTIR

Hasil spektrum FTIR isolat E.2.2.2 menunjukkan serapan pada bilangan gelombang

3446,85 cm-1 merupakan vibrasi ulur OH diperkuat dengan serapan 1398,15 cm-1 yang

merupakan OH tekuk. Adanya serapan pada bilangan gelombang 2925 cm-1 merupakan

vibrasi ulur CH alifatik (asimetri) dan bilangan gelombang 2854,03 cm-1 merupakan

serapan vibrasi ulur CH alifatik (simetri) dan 1398,15 cm-1 merupakan vibrasi tekuk CH3.

Keberadaan gugus asam karboksilat ditunjukkan serapan pada bilangan gelombang

1740,74 cm-1 merupakan vibrasi ulur C=O dan serapan pada 1114,71 cm-1 yang

merupakan C-O asam karboksilat.

 HASIL FTIR

• Pola serapan FTIR ISOLAT E.2.2.2

• Hasil analisis FTIR isolat E.2.2.2

menunjukkan adanya gugus fungsi O-H, C-

H alifatik, C=O asam karboksilat, C=C

aromatik, substitusi aromatik, dan C-O

eter.
 HASIL

• Profil KLT isolat E.2.2.2 dengan fase diam silika gel GF254 dan

fase gerak etil asetat : n-heksana (6:4) diamati dalam lampu

UV365 (a) isolat E.2.2.2 (b) asam ferulat (c) asam kafeat (d)

asam galat
 HASIL

• Berdasarkan gambar 8 menunjukkan

bahwa isolat E.2.2.2 merupakan

golongan asam fenolat yaitu asam

ferulat karena isolat E.2.2.2 mempunyai

• Profil KLT isolat E.2.2.2 dengan fase diam silika gel GF254
Rf yang sama dengan asam ferulat

dan fase gerak etil asetat : n-heksana (6:4) diamati

standar yaitu 0,76

dalam lampu UV365 (a) isolat E.2.2.2 (b) isolat+asam

ferulat (c) asam ferulat

 KESIMPULAN

• Fraksi paling aktif kulit durian yang berpotensi sebagai antimikroba terhadap bakteri

Staphylococcus aureus, Escherichia coli dan jamur Candida albicans yaitu fraksi etil asetat.

Analisis isolat E.2.2.2 dari fraksi etil asetat kulit durian dengan spektrofotometer UV-Vis

menunjukkan panjang gelombang 205 nm, 236 nm dan 270-300 nm, analisis

spektofotometer FTIR menunjukkan adanya gugus O-H, =C-H aromatik, C=C aromatik,
substitusi aromatik, C=O asam karboksilat, C=C alkena dan C-O eter dan KLT dengan

standar asam fenolat diprediksi bahwa isolat E.2.2.2 merupakan golongan senyawa asam

fenolat yaitu asam ferulat.

 DAFTAR PUSTAKA

Miller, A., L. (1996). Antioxidant Flavonoids : Structure, Function and Clinical Usage.

Alt. Med. Rev. 1(2)

Harborne,J.B.1987, Metode Fitokimia Penutun dan Cara Modern Menganaisis

Tumbuhan, a.b. Kosasih Padmawinata, ITB, Bandung 7

Peter, L. 2010. Thin Layer Chromatography Characterization of the Active Ingredients

in Excedrin and Anacin. Stevens Institute of Technology. Hoboken

Jurnal Insan Farmasi Indonesia, 4(1) Mei 2021 (1-6) Ade Ferdinand p-ISSN 2621-3184 ;

e-ISSN 2621-4032 doi: 10.36387/jifi.v4i1.642

Moh Djaeni, AP Aji Prasetyaningrum, Kelayakan biji durian sebagai bahan pangan

alternatif: Aspek nutrisi dan tekno ekonomi, Riptek, 4, 11, (2010) 3745
TERIMA KASIH