PERCOBAAN V

I. JUDUL PERCOBAAN : KROMATOGRAFI KOLOM

II. TANGGAL PERCOBAAN : 28 Nopember 2016

1. Latar Belakang :
1.1. Definisi Kromatografi
Kromatografi terdiri dari dua fase, fase gerak dan fase diam, Menurut
Alimin (2007:115), dalam proses kromatografi selalu terdapat salah satu
kecenderungan molekul-molekul komponen untuk melarut dalam cairan, melekat
pada permukaan padatan halus, bereaksi secara kimia dan terekslusi pada pori-pori
fasa diam. Komponen yang dipisahkan harus larut dalam fasa gerak dan harus
mempunyai kemampuan untuk berinteraksi dengan fasa diam dengan cara melarut
di dalamnya, teradsorpsi atau bereaksi secara kimia. Pemisahan terjadi berdasarkan
perbedaan migrasi zat-zat yang menyusun suatu sampel. Hasil pemisahan dapat
digunakan untuk keperluan analisis kualitatif, analisis kuantitatif dan pemurnian
suatu senyawa. Dalam beberapa hal metode pemisahan kromatografi mempunyai
kemiripan dengan metode pemisahan ekstraksi. Kedua metode ini sama-sama
menggunakan dua fasa, dimana fasa satu bergerak terhadap fasa lainnya,
kesetimbangan solut selalu terjadi di antara kedua fasa.
Ada beberapa pembagian kromatgografi, diantaranya kromatografi cair-
cair, Menurut Khopkar (2008:223), Dalam kromatografi partisi cair-cair, suatu
pemisahan dipengaruhi oleh distribusi sampel antara fase cair diam dan fase cair
bergerak dengan membatasi kemampuan pencampuran. Jika suatu zat terlarut
dikocok dalam sistem dua pelarut yang tidak bercampur atau saling melarutkan
maka zat terlarut akan terdistribusi di antara kedua fase.
Metode pemisahan dalam kimia diantaranya kromatografi, Menurut
Hendayana (2006:127), menyatakan bahwa Metode pemisahan kromatografi kolom
ini memerlukan bahan kimia yang cukup banyak sebagai fasa diam dan fasa
bergerak bergantung pada ukuran kolom gelas. Untuk melakukan pemisahan
campuran dengan metode kromatografi kolom diperlukan waktu yangcukup lama,
bias berjam-jam hanya untuk memisahkan satu campuran. Selain itu, hasil
pemisahan kurang jelas artinya kadang-kadang sukar mendapatkan pemisahan
secara sempurna karena pita komponen yang satu bertumpang tindih dengan
komponen lainnya. Masalah waktu yang lama disebabkan laju alir fasa gerak hanya
dipengaruhi oleh gaya gravitasi bumi, ukuran diameter partikel yang cukup besar
membuat luas permukaan fasa diam relative kecil sehingga tempat untuk
berinteraksi antara komponen-komponen dengan fasa diam menjadi terbatas.
Apabila ukuran diameter partikel diperkecil supaya luas permukaan fasa diam
bertambah menyebabkan semakin lambatnya aliran fasa gerak atau fasa gerak tidak
mengalir sama sekali. Selain itu fasa diam yang sudah terpakai tidak dapat
digunakan lagi untuk pemisahan campuran yang lain karena sukar meregenerasi
fasa diam.

1
 1.2. Mengapa Perlu dilakukanya Pemisahan dengan Kromatografi Lapis
Tipis
Metode pemisahan merupakan aspek penting dalam dibidang analisis
karena kebanyakan sampel yang akan dianalisis berupa campuran. Untuk
memperoleh senyawa murni dari suatu campuran, harus dilakukan proses
pemisahan. Berbagai teknik pemisahan dapat diterapkan untuk memisahkan
campuran diantaranya ekstraksi, destilasi, kristalisasi dan kromatografi. Metode
pemisahan pada kromatografi sangat tergantung dari jenis fase diam yang
digunakan. Jenis fase diam yang digunakan menentukan interaksi yang terjadi
antara analit dengan fase dia dan fase gerak. Metode pemisahan pada kromatografi
terbagi Pemisahan berdasarkan polaritas. Metode pemisahan berdasarkan polaritas,
senyawa senyawa terpisah karena perbedaan polaritas. Afinitas analit tehadap fase
diam dan fase gerak tergantung kedekatan polaritas analit terhadap fase diam dan
fase gerak (like dissolve like). Kromatografi kolom adalah pemisahan pertama yang
berdasarkan perbedaan polaritas atau afinitas zat tersebut, setelah itu senyawa yang
sudah dipisahkan dikarakterisasi dan dipisahkan lagi secara kromatografi kolom.

1.3.Penelitian Terdahulu Tentang Kromatografi Lapis Tipis

Percobaan tentang kromatografi pernah juga pernah dilakukan oleh A. R.
Astiti Asih, dkk (2008 : Vol. 2 No. 2, 112) tentang isolasi senyawa golongan
flavonoi Sebanyak 1,5 kg serbuk kering kulit batang Bungur dimaserasi dengan n-
heksan, sehingga diperoleh ekstrak kental n-heksana. Residu dari kulit batang
Bungur kemudian dikeringkan. Residu kulit batang Bungur yang telah kering
tersebut dimaserasi lagi dengan menggunakan metanol, sehingga diperoleh ekstrak
kental metanol. Ekstrak kental n-heksan dan ekstrak kental metanol kemudian
ditimbang dan diuji fitokimia, jika ekstrak kental metanol yang positif flavonoid
maka ekstrak kental metanol yang diperoleh kemudian ditambah metanol : air (7:3),
dan ekstrak airnya dipartisi dengan etilasetat dan n-butanol sehingga diperoleh
fraksi etilasetat, fraksi n-butanol dan fraksi air. Fraksi-fraksi ini dipekatkan,
sehingga diperoleh fraksi etilasetat, fraksi n-butanol dan fraksi air. Pemisahan dan
pemurnian senyawa flavonoid dapat dilakukan dengan Kromatografi Lapis Tipis
dan Kromatografi Kolom sampai diperoleh isolate yang positif flavonoid dan relatif
murni yang dapat diuji kemurniannya menggunakan analisis KLT pada berbagai
campuran fase gerak. Selanjutnya isolate relatif murni diidentifikasi menggunakan
spektrofotometer Ultra Violet-Visibel dan spektrofotometer Inframerah. Pemisahan
ekstrak kental n-butanol menggunakan Kromatografi Kolom dengan eluen n-
butanol : asam asetat : n-heksan dengan perbandingan (3:3:2). Hasil Kromatografi
Kolom adalah 100 fraksi (tiap fraksi 3 mL), yang selanjutnya diuji dengan
Kromatografi Lapis Tipis untuk penggabungan. Fraksi-fraksi yang menampakan
noda dengan pola pemisahan yang sama digabungkan, sehingga diperoleh 3
kelompok fraksi (F1, F2, F3) yang mempumyai pola pemisahan yang berbeda.
Masing masing fraksi (F1, F2, F3), diuapkan, ditimbang, serta diuji fitokimia,
untuk mengetahui fraksi yang positif mengandung senyawa flavonoid.

2
 Kromatografi kolom juga pernah dilakukan oleh Hernani (2002 : Vol. 1.
No. 1, 22), Eluen yang digunakan untuk mengeluasi adalah campuran etil asetat +
kloroform + petroleum eter = 5 + 95 + 5, etil asetat dan metanol. Sistem eluasi yang
digunakan secara gradient. Sebelum contoh dimasukkan, kolom harus dikondisikan
selama 1 malam sampai padatan isi kolom terlihat kompak. Timbang 2 g CNSL,
kemudian dilarutkan dalam terpentin sampai terlarut secara sempurna. Larutan
kemudian dimasukkan ke dalam kolom secara hati-hati. Cairan yang keluar
ditampung dalam tabung reaksi untuk setiap 3 ml. Setiap fraksi dianalisis dengan
kromatografi lapis tipis dengan eluen campuran dietileter + sikloheksan = 3 + 1.
Sebagai larutan penampak adalah serium (IV) sulfat. Fraksi-fraksi yang mempunyai
jumlah noda yang sama dikumpulkan menjadi satu. Untuk analisis secara
kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) menggunakan kolom Lichrosob OV 18;
eluen campuran n-heksan + etil asetat = 2+1; kecepatan alir 0,5 ml/menit; detektor
UV pada panjang gelombang 285 nm. Untuk analisis secara GCMS menggunakan
kolom kapiler dengan panjang 20 m dan diameter dalam 0,25 mm. Suhu kolom
terprogram 100-250 C/10C/menit. Temperatur injektor = 250C, gas pembawa
helium dengan kecepatan alir 10 ml/menit. Isolasi kardanol secara kolom
kromatografi dengan isi silika gel menghasilkan rendemen 66,5 % dan indeks bias
1,5052. Hasil analisis secara KLT menunjukkan satu spot yang melebar pada harga
Rf 0,63. Sedangkan analisis secara HPLC mendapatkan juga satu puncak. Dari
identifikasi menunjukkan bahwa kardanol yang dihasilkan adalah monoolefin atau
mempunyai satu ikatan rangkap dengan kemurnian 90 %.
Identifikasi senyawa KmnO4 juga pernah dilakukkan oleh Reni Rosalina,
dkk (2015 : Vol. 18. No.2), Pelarut p.a. yang digunakan, yaitu kloroform (CHCl3),
dan metanol (MeOH). Pelarut teknis yang dipakai adalah metanol (MeOH) dan
meti-len klorida (CH2Cl2) Proses monitoring reaksi, pemisahan, dan pemurnian
dilakukan dengan teknik kromatografi. Kromatografi lapis tipis (KLT)
menggunakan pelat aluminium ber-lapis silika gel Merck Kieselgel 60 F254 dengan
ketebalan 0,25 mm untuk memo-nitor reaksi, kromatografi kolom gravitasi (KKG)
menggunakan silika gel Merck 60 (35-70 mesh) untuk proses pemurnian, kro-
matografi radial (KR) menggunakan silika gel Merck Si-Gel 60 PF254 untuk proses
pemurnian. Reagen Dragendroff digunakan sebagai pereaksi penampak noda pada
KLT. Reaksi oksidasi dilakukan dalam sua-sana asam di mana pada suasana asam
dengan kekuatan oksidasi yang besar, maka ion permanganat secara teoretis dapat
mengoksidasi beberapa gugus fungsi pada kinin. Pada kinin terdapat beberapa
gugus fungsi yang reaktif terhadap reaksi oksidasi yaitu olefin yang dapat
teroksidasi menjadi diol atau produk fragmentasi, nitrogen pada cincin kuinuklidin
yang dapat teroksidasi menjadi senyawa N-oksida, dan alkohol sekunder yang dapat
teroksidasi menjadi keton atau produk fragmentasi. Produk epimer aldehid
merupakan produk dari oksidasi yang terjadi pada gu-gus vinil pada kinin.
Berdasarkan hasil tersebut, maka dapat diketahui bahwa metode reaksi dengan
permanganat ini dapat digunakan untuk fungsionalisasi gugus vinil pada kinin.
Sedangkan untuk pemutusan ikatan C-C yang menghasilkan kinin karboksilat
masih diperoleh rendemen yang sangat sedikit, dan metode oksidasi dengan
permanganat ini kurang selektif apabila digunakan pada substrat yang memiliki
banyak gugus fungsi seperti kinin. Dari percobaan ini maka hasil yang didapatkan
adalah Oksidasi kinin dengan kondisi yang dilakukan berhasil diperoleh senyawa
kinin-1-N-oksida dan kininal.

3
2. Tujuan Penulisan
Adapun tujuan percobaan ini adalah untuk :
1. Mengetahui apa kelebihan dan kekurangan kromatografi kolom.
2. Mendeskripsikan bagaimana prinsip keja kromatografi kolom.
3. Memahami tekhnik-teknik dasar kromatografi kolom.

3. Tinjauan Pustaka
Pemisahan Kromatografi, Menurut Underwood (2002:224), Pemisahan
kromatografi kolom adsorpsi didasarkan pada adsorpsi komponen-komponen
campuran dengan afinitas berbeda-beda terhadap permukaan fase diam.
Kromatografi kolom terabsorpsi termasuk pada cara pemisahan cair padat, substrat
padat bertindak sebagai fasa diam yang sifafnya tidak larut dalam fasa cair, fasa
bergeraknya adalah cairan atau pelarut yang mengalir membawa komponen
campuran sepanjang kolom. Pemisahan bergantung pada kesetimbangan yang
terbentuk pada bidang antar muka diantara butiran-butiran adsorben dan fase
bergerak serta kelarutan relatif komponen pada fasa bergeraknya. Antara molekul-
molekul komponen dan pelarut terjadi kompetisi untuk teradsorpsi pada permukaan
adsorben sehingga menimbulkan proses dinamis. Keduanya secara bergantian
tertahan beberapa saat di permukaan adsorben dan masuk kembali pada fasa
bergerak.
Ada beberapa keuntungan dalam kromatografi, Menurut Alimin (2007:116),
keuntungan pemisahan dengan metode kromatografi adalah
a. Dapat digunakan untuk sampel atau konstituen yang sangat kecil.
b. Cukup selektif terutama untuk senyawa-senyawa organik multi komponen.
c. Proses pemisahan dalam dilakukan dalam waktu yang relatif singkat.
d. Seringkali murah dan sederhana karena umumnya tidak memerlukan alat
yang mahal dan rumit.
Berbagai ukuran kolom dapat digunakan, dimana hal utama yang
dipertimbangkan adalah kapasitas yang mamadai untuk menerima sampel-sampel
tanpa melamapaui fasa diamnya. Merupakan aturan praktis yang umum bahwa
panjang kolom harus sekurang-kurangnya sepuluh kali ukuran diameternya. Bahan
pengemasnya, suatu adsorsben seperti alumina atau mungkin suatu resin pertukaran
ion, dimasukkan dalam bentuk suspense ke dalam porsi fasa bergerak dan dibiarkan
diam di dalam hamparan basah dengan sedikit cairan tetap berada di atas
permukaannya. Keran dibuka, dan permukaan cairan dibiarkan turun sampai
mencapai puncak permukaan hamparan kemudian porsi kecil dari larutan sampel
dipipet dengan hati-hati ke atas puncak permukaan hamparan. Larutan efluen
keluaran dikumpulkan dalam sederatan fraksi volume yang tidak merepotkan.
Larutan tersebut dapat menetes jatuh ke dalam sebuah gelas beker atau tabung uji
tiap kali telah terkumpul sejumlah volume tertentu.

4
4. Alat dan Bahan
4.1. Alat
No. Nama Alat Ukuran Jumlah Gambar
1. Gelas kimia 250 mL -

2. Gelas ukur 50 mL -

3. Batang statif - -

4. Erlenmeyer 250 mL -

5
 4.2. Bahan
No. Nama Bahan Ukuran Jumlah Gambar

1. Aluminum oksida 20 gram -

2. KMnO4 5 mL -

3. K2Cr2O7 5 mL -

6
 4. 1-Butanol 20 mL -

5. Prosedur Kerja dan Pengamatan

No Prosedur Kerja Hasil Pengamatan Reaksi
. Perhitungan
1. Didalam kolom -
kromatografi yang
telah di bersihkan
dimasukkan penjerap
aliminium oksida
yang dibasahi dengan
air setinggi 10 cm.

2. Melalui corong -
ditambah pelarut 1-
butanol hingga
mencapai 1 cm diatas
permukaan penjerap,
dimasukkan slika gel
dan n-heksana
sebanyak 20 ml.

3. Dimasukkan 1 mL
sampel KMnO4 dan KMnO4 +
K2Cr2O7 yang telah KCrO7 Mn
dicampurkan, 2+
+ CrO4
kemudian dibuka
keran kolom nya dan
di biarkan cairan
dalam kolom akan
turun membawa
komponen-komponen
campurannya.

7
 4. Proses ini di teruskan -
hingga didapat semua
komponen keluar dari
kolom dan di tampung
di tempat yang
berbeda, hingga di
dapat 3 fraksi.
Disiapkan gelas kimi
dibawah kran. Waktu
yang dibutuhkan
untuk keluar eluennya
beberapa jam, lalu
setelah eluennya
keluar, di pisahkan
dengan dua gelas
kimia yang berbeda.

6. Pembahasan
Pada percobaan kromatografi kolom Fase diam nya adalah silica gel dan fase
geraknya adalah hasil impregnasi antara ekstrak dan silica gel. Langkah pertama
yang kami lakukan yaitu menyiapkan alat dan bahan yang dibutuhkan. Didalam
kolom kromatografi yang telah di bersihkan dimasukkan penjerap aliminium oksida
yang dibasahi dengan air setinggi 10 cm. Kemudian dimasukkan slika gel dan n-
heksana sebanyak 20 mL selanjutnya dimasukkan sampel KMnO4 dan K2Cr2O7
sebanyak 1 mL yang bewarna merah hati dan 10 mL larutan 1-butanol kemudian
dibuka keran kolom nya dan di biarkan cairan dalam kolom akan turun membawa
komponen-komponen campurannya, ternyata yang duluan keluar adalah K2Cr2O7
karena larutan tersebut lebih bersifat non polar. Proses ini di teruskan hingga semua
komponen keluar dari kolom dan di tampung di tempat yang berbeda. Dan setelah
ditunggu beberapa menit didapat fraksi2 nya. Yaitu, fraksi pertama bewarna keruh,
yang kedua bewarna kuning sedangkan fraksi yang ke 3 tidak bewarna.
Menurut jurnal yang di kemukakan oleh Mursiti (2013 : Vol. 36, No. 2),
Setiap fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom dianalisis dengan KLT
menggunakan lampu UV. Uji alkaloid menggunakan pereaksi Dragendorff 130 dan
132. Fraksi yang positif merupakan fraksi yang mengandung alkaloid. Kemudian
fraksi ini dianalisis lebih lanjut untuk identifikasi struktur dengan GC, spektrometer
IR, UV, dan 169 HNMR. Hasil analisis menunjukkan bahwa dalam ekstrak
diperkirakan terdapat senyawa alkaloid yakni 3,4,5-trietil-6-metoksi-2-metil-1,2-
dihidro-piridin. Sedangkan pada praktikum di dapat 3 fraksi yaitu fraksi pertama
bewarna keruh, yang kedua bewarna kuning sedangkan fraksi yang ke 3 tidak
bewarna.

8
7. Penutup
7.1. Kesimpulan
Berdasarkan praktikum yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa:
1. Ekstraksi adalah Prinsip dasar kromatografi kolom adalah pemisahan
senyawa menjadi komponen-komponennya berdasarkan perbedaan
kecepatan perpindahan masing-masing komponen diantara dua fasa.
2. Pada percobaan di dapat perbedaan 3 fraksi yaitu yaitu fraksi pertama
bewarna keruh, yang kedua bewarna kuning sedangkan fraksi yang ke
3 tidak bewarna.Pada percobaan kromatografi kolom Fase diam nya
adalah silica gel dan fase geraknya adalah hasil impregnasi antara
ekstrak dan silica gel.
3. Teknik kromatografi kolom berdasarkan terapan atau adsorpsi jenis
fasa yang digunakan, dimana fasa diam berupa adsorben yang tidak
boleh larut dalam fasa gerak dengan menggunakan kolom dengan
penambahan fasa gerak, ditampung, dipisahkan, dan diidentifikasi.

7.2. Saran
Dalam melakukan kegiatan praktikum ini, diharapkan Praktikan lebih
berhati-hati, cermat, dan tidak ceroboh dalam melaksanakan percobaan agar
mendapat hasil yang baik dan menghindari kesalahan. Pada percobaan selanjutnya
diharapkan Lab kimia memilik alat yang cukup untuk pratikum sehinnga semua
kelompok dapat melakukan pratikum sebagaiman harusnya.

9
 DAFTAR PUSTAKA

Alimin.2007. Analisis Kuantitatif. Jakarta : Erlangga.

Hendayana, Sumar. 2006. Kimia Pemisahan. Bandung: PT. Remaja Rosdakarya.

Hernani. 2002. Isolasi Kardanol dari CNSL (Cashew Nut - Shell Liquid) Secara
Kromatografi Kolom. Jurnal Bahan Alam Indonesia : Vol. 1. No. 1, 21-24,
diakses tanggal 27 Oktober 2016.

Khopkar. 2008. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: Erlangga.

Mursiti 2013. Isolasi, Identifikasi, Dan Elusidasi Struktur Senyawa Alkaloid Dalam
Ekstrak Metanol-Asam Nitrat Dari Biji Mahoni Bebas Minyak (Swietenia
Macrophylla, King). Jurnal MIPA, 36 (2): 169-177, diakses tanggal 4
Desember 2016.

R. Astiti Asih, dkk. 2008. Senyawa Golongan Flavonoid pada Ekstrak N-Butanol
Kulit Batang Bungur (Lagerstroemia Speciosa Pers.). Jurnal Kimia : Vol. 2
No. 2, diakses tanggal 27 Oktober 2016.

Reni Rosalina, dkk. 2015. Reaksi oksidasi dengan kalium permanganat (KMnO4)
pada senyawa kinin. Jurnal Penelitian Teh dan Kina : Vol. 18. No.2, diakses
tanggal 3 Desember 2016 .

10