LABORATORIUM FARMAKOGNOSI-FITOKIMIA

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS HASANUDDIN

LAPORAN LENGKAP INDIVIDU

KLT DUA DIMENSI DAN MULTI ELUEN

KELOMPOK 6 WAHYU DIRGANTARA

RIKA RIYANTI

ADE ANDINI

SITI FATIMAH H

FITRIA DEWI

ELFIN FAIRUNAN

ERNA SOLEH

APURWANTI

GOLONGAN

RABU SIANG
 BAB I

PENDAHULUAN

I.1. Latar Belakang

Kromatografi lapis tipis merupakan metode yang digunakan

untuk memisahkan substansi campuran menjadi komponen-

komponennya dengan menggunakan prinsip adsorpsi dan partisi.

Kroamtografi lapis tipis dikembangkan oleh Izmailoff dan Schraiber pada

tahun 1983. Dimana KLT merupakan bentuk dari kromatografi planar,

selain kromatografi kertas dan elektroforesis. Fase diam yang digunakan

berupa lapisan yang seragam (Uniform) pada bidang datar dan didukung

oleh lempeng kaca, pelat aluminium atau pelat plastik. Sedangkan fase

gerak yang digunakan sebagai pelarut pengembang akan bergerak

sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan

secara menaik (ascending) atau karena pengaruh gravitasi pada

pengembangan secara menurun (discending).

Adapun variasi dalam prosedur pengembangan KLT serta

adanya fase diam yang telah dikembangkan yang dimana bertujuan

untuk meningkatkan resolusi, sensitifitas, kecepatan, reprodusibelitas,

dan selektifitasnya, salah satunya yaitu KLT 2 arah atau dikenal dengan

nama KLT 2 dimensi.

 KLT 2 arah atau 2 dimensi ini bertujuan untuk meningkatkan

resolusi sampel ketika komponen-komponen solute mempunyai

karakteristik kimia yang hamper sama, karenanya nilai Rf juga hamper

sama sebagaimana dalam asam-asam amino. Selain itu, 2 sistem fase

gerak yang sangat berbeda dapat digunakan secara beurutan pada suatu

campuran tertentu sehingga memungkinkan untuk melakukan pemisahan

analit yang mempunyai tingkat polaritas yang berbeda.

Multi eluen merupakan metode pemisahan yang memiliki

prinsip yang sama dengan KLT 2 dimensi yaitu adsorbsi dan partisi, Pada

metode multi eluen jumlah totolan berbeda yaitu berupa cuplikan yang

berkesinambungan dan menghasilkan hasil elusi yang berupa pita.

I.2. Maksud dan Tujuan Percobaan

I.2.1. Maksud Percobaan

Mengetahui dan memahami teknik untuk menguji kemurnian hasil

isolasi komponen kimia dari bahan alam, yaitu sampel temu putih

(curcuma zedoaria) dengan menggunakan metode kromatografi lapis tipis

dua dimensi dan kromatografi multi eluen.

I.2.2. Tujuan Percobaan

Melakukan teknik pengujian kemurnian hasil isolasi komponen kimia

dari sampel temu putih (curcuma zedoaria) terhadap fraksi C2 dengan

menggunakan metode kromatografi lapis tipis dua dimensi dan

kromatografi lapis tipis multi eluen.

I.2. Prinsip Percobaan

1. Prinsip dari multi eluen yaitu adsorpsi dan partisi dengan

menggunakan lempeng GF 254 sebagai fase diam dengan beberapa

perbandingan eluen pada tingkat kepolaran tertentu untuk mempertegas

adanya senyawa tunggal yang terdapat pada sampel temu putih

(curcuma zedoaria).

2. Prinsip dari KLT dua dimensi adalah adsorpsi dan partisi dengan

menggunakan lempeng GF 254 sebagai fase diam dan perbandingan

eluen pada profil KLT dimana akan memperpanjang lintasan noda (Rf)

dengan menunjukkan senyawa tunggal yang terdapat pada sampel temu

putih (curcuma zedoaria).

 BAB II

TINJAUN PUSTAKA

II.1. Uraian Sampel

Kingdom : Plantae

Phylum : Tracheophyta

Class :Lliliopsida

Family : Zingiberaceae

Genus : Curcuma

Species : Curcuma zedoaria

II.2. Teori Umum

KLT dua dimensi dan multi eluen memiliki prinsip yang sama yaitu

adsorbsi dan partisi, tetapi yang membedakan pada KLT dua dimensi

didasarkan pada proses elusi yang bertujuan untuk memperpanjang jarak

lintasan noda untuk memperoleh senyawa tunggal sedangkan pada multi

eluen jumlah totolannya yang berbeda yaitu berupa cuplikan yang

berkesinambungan dan menghasilkan hasil elusi berupa pita.(2)

KLT dua dimensi merupakan metode pemisahan yang pada umunya

cukup sering digunakan. Namun kebanyakan pemisahan dengan metode

dua dimensi memakan waktu seharian untuk melakukannya dan hanya

satu sampel per lempeng yang bisa dianalisa dalam satu waktu. Hasilnya

adalah suatu kromatogram seperti cetakan jari, mengidentifikasi noda

dengan membandingkannya dengan standar sangat memakan waktu dan

harus dilakukan terpisah pada kondisi eluen yang sama. Dalam hal ini

untuk mendapatkan resolusi yang baik, penting untuk memilih dua

campuran pelarut yang berbeda, meskipun dengan kekuatan pelarut yang

sama.(1)

KLT dua dimensi ini bertujuan untuk meningkatkan resolusi sampel

ketika komponen-komponen solute mempunyai karakteristik kimia yang

hampir sama, karenanya nilai Rf juga hampir sama sebagaimana dalam

asam-asam amino. Selain itu, sistem dua fase gerak yang sangat berbeda

dapat digunakan secara berurutan pada suatu campuran sehingga

memungkinkan untuk melakukan pemisahan analit yang mempunyai

tingkat polaritas.(1)

Elusi dengan metode dua dimensi diidealkan dengan menggunakan

sistem fase gerak yang sama untuk dua arah. Pada elusi dengan metode

seperti ini sampel ditotolkan lalu dikembangkan dengan satu sistem fase

gerak sehingga campuran terpisah menurut jalur yang sejajar dengan

salah satu sisi. Lempeng diangkat, dikeringkan dan diputar 90˚C dan

diletakkan kedalam chamber yang berisi fase gerak yang kedua sehingga

bercak yang terpisah pada pengembangan pertama terletak dibagian

bawah sepanjang lempeng lalu dikromatografi lagi. Komponen yang

terpisah dapat terdapat dimana saja dalam lempeng.(1)

 Mekanisme KLT dua dimensi

Uji kemurnian Kristal juga dilakukan dengan menggunakan beberapa

variasi eluen yang sesuai. Penampakan bercak tunggal menandakan

bahwa golongan senyawa dari Kristal yang didapat merupakan golongan

komponen kimia yang tunggal. (3)

Multi eluen merupakan teknik pemisahan dengan penggunaan eluen

atau fase gerak yang berbeda yang memungkinkan terjadinya pemisahan

analit dengan berdasarkan pada tingkat polaritas yang berbeda-beda.(1)

Kromatografi lapis tipis multi eluen dilakukan terhadap isolat yang

mengkristal, dengan tujuan mengetahui apakah Kristal yang diperoleh

merupakan senyawa tunggal atau bukan. Eluen yang biasa digunakan

untuk kromatografi lapis tipis multi eluen adalah Heksan : etil (4:1),

Kloroform : etil (2:1) dan kloroform : aseton (2:1). (7)

Pemisahan komponen suatu senyawa yang dipisahkan dengan

kromatografi lapis tipis tergantung pada jenis pelarut, zat penyerap

dengan sifat daya serap masing-masing komponen. Komponen yang

terlarut akan terbawa oleh fase diam (penyerap) dengan

membandingkannya dengan standar sangat memakan waktu dan harus

dilakukan terpisah pada kondisi eluen yang sama. Dalam hal ini untuk

mendapatkan resolusi yang baik, penting untuk memilih dua campuran

pelarut yang berbeda, meskipun dengan kekuatan pelarut yang sama (1).

Jarak yang ditempuh senyawa terlarut

Rf =
Jarak yang ditempuh pelarut

Jarak antara jalannya pelarut bersifat relatif. Oleh karena itu,

diperlukan suatu perhitungan tertentu untuk memastikan spot yang

terbentuk memiliki jarak yang sama walaupun ukuran jarak plat nya

berbeda. Nilai perhitungan tersebut adalah nilai Rf, nilai ini digunakan

sebagai nilai perbandingan relatif antar sampel. Nilai Rf juga menyatakan

derajat retensi suatu komponen dalam fase diam sehingga nilai Rf sering

juga disebut faktor retensi (5)

Semakin besar nilai Rf dari sampel maka semakin besar pula jarak

bergeraknya senyawa tersebut pada plat kromatografi lapis tipis. Saat

membandingkan dua sampel yang berbeda di bawah kondisi kromatografi

yang sama, nilai Rf akan besar bila senyawa tersebut kurang polar dan

berinteraksi dengan adsorbent polar dari plat kromatografi lapis tipis. Nilai

Rf dapat dijadikan bukti dalam mengidentifikasikan senyawa. Bila

identifikasi nilai Rf memiliki nilai yang sama maka senyawa tersebut dapat
dikatakan memiliki karakteristik yang sama atau mirip. Sedangkan, bila

nilai Rfnya berbeda, senyawa tersebut dapat dikatakan merupakan

senyawa yang berbeda. (6)

Sebagai contoh, jika komponen berwarna merah bergerak 3,5 cm

dari garis awal sementara pelarut berjarak 5,0 cm, sehingga nilai Rf untuk

komponen berwarna merah menjadi :

Jarak yang Garis depan

ditempuh fase gerak Jarak yang ditempuh solut (A)

(B)
B
Garis awal penotolan

Sampel yang ditotol

Jarak yang ditempuh solute (A)

Rf =
Jarak yang ditempuh fase gerak (B)

3,5
Rf =
5,0
= 0,7 cm
Tabel 6. Nilai Konstanta dielektrik dan parameter kelarutan Hildebrand
pelarut alkaloid gadung (Mandal dkk, 2007 ; Kang
dkk, 2001)
1/2
Pelarut Parameter Kelarutan Hildebrand (Mpa ) Konstanta dielektrik
Air 48 78,3
Metanol 29,7 32,6
Etanol 26,1 24,3
2-propanol 23,8 19,9
Aseton 19,7 20,7
Kloroform 18,7 4,81
Metil Eter 18,6 5
Dietil Eter 15,4 4,3
Benzen 18,6 2,3
Petroleum eter 15,8 4,3
 BAB III

METODE KERJA

III.1. Alat dan Bahan

III.1.1. Alat

Adapun alat-alat yang digunakan antara lain, botol semprot,

chamber, cawan porselin, lempeng ukuran 10 x 10 cm, gegep, gelas ukur,

gunting, oven, penggaris, pensil, pipa kapiler, pipet tetes, tabung

sentrifuge, alat sentrifuge (magnetic stirrer), tabung reaksi, lampu UV 254

dan 366 nm, dan vial.

III.1.2. Bahan

Bahan-bahan yang digunakan antara lain, etil asetat, H 2SO4 10 %,

heksan, kertas label, kertas saring, kloroform, lempeng KLT, metanol,

sampel temu putih (curcuma zedoaria) silika kasar.

III.2. Cara Kerja

1. Multi Eluen

- Disiapkan alat dan bahan

- Dari hasil kerukan KLTP direndam dengan metanol dan kloroform

PA selama 5 menit, kemudian disentrifuge selama 15 menit.

- Dari hasil sentrifuge dipindahkan kedalam vial dan diuapkan

- Dilarutkan kembali dengan kloroform (1 vial) setelah menguapkan

- Siapkan 3 lempeng yang telah diaktifkan

 - Hasil sentrifuge ditotolkan pada lempeng

- Disiapkan perbandingan eluen dari non polar hingga polar

Setelah dielusi dengan tiga eluen yang berbeda, dilihat

penampakan noda pada lampu UV 254 nm dan 366 nm

2. KLT Dua dimensi

- Disiapkan alat dan bahan

- Ditotolkan isolate pada salah satu sisi lempeng dengan ukuran 20

x 20 atau 10 x 10.

- Masukkan kedalam chamber yang telah dijenuhkan dengan eluen

pertama.

- Biarkan lempeng terelusi sempurna kemudian angkat dan

keringkan.

- Putar lempeng 90˚C kemudian masukkan kembali ke dalam

chamber yang berisi eluen kedua.

- Biarkan lempeng terelusi sempurna kemudian angkat dan

keringkan.

- Amati noda yang muncul dengan sinar UV 254/366 nm dan

H2SO4.
 BAB IV

HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

IV.1. Hasil Pengamatan

IV.1.1. Data Pengamatan

Eluen Perbandingan Pita

Eluen

MeOH : Etil 3:1 Coklat

KLT Multi Eluen

IV.1.2. Gambar

1. Multi Eluen

UV 254 UV 366
IV.2. Pembahasan

Kromatografi dua dimensi dan multi eluen merupakan metode

pemisahan dengan prinsip yang sama yaitu adsorbsi dan partisi, tetapi

yang membedakan pada KLT dua dimensi didasarkan pada proses elusi

yang bertujuan untuk memperpanjang jarak lintasan noda untuk

memperoleh senyawa tunggal sedangkan pada multi eluen jumlah

totolannya yang berbeda yaitu berupa cuplikan yang berkesinambungan

dan menghasilkan hasil elusi berupa pita.

Pada praktikum dilakukan proses dua dimensi dengan menggunakan

sampel dari hasil kerokan KLTP.

Mula-mula hasil kerokan dari lempeng KLTP direndam dengan

metanol dan kloroform PA dengan perbandingan 1 : 1 selama 5 menit,

setelah itu disentrifuge selama 15 menit dan hasil dari sentrifuge

ditampung dalam vial dan diuapkan. Metanol digunakan berdasarkan

pemilihan fraksi untuk penotolan KLTP yang telah dilakukan sebelumnya.

Karena fraksi yang dipilih adalah fraksi V, maka pelarut yang digunakan

untuk melarutkan ekstrak dalam vial adalah metanol. Karena seperti yang

telah diketahui metanol bersifat semi polar berarti kepolarannya berada

ditengah-tengah dan fraksi yang dipilih adalah fraksi V yang diketahui

mengandung ekstrak yang kepolarannya berada ditengah-tengah pula.

 Setelah disentrifus dengan menggunakan pelarut metanol, hasil

sentrifius kemudian dipisahkan dan ditampung dalam vial kemudian

diuapkan.

Untuk pengerjaan multi eluen, ekstrak yang telah disentrifius

dilarutkan dengan kloroform. Digunakan kloroform karena pelarut tersebut

baik untuk penotolan pada lempeng sebab memenuhi syarat pelarut yang

bisa digunakan untuk melarutkan ekstrak dan mudah menguap. Setelah

ekstrak dilarutkan dengan kloroform totol pada lempeng yang telah

disiapkan dengan menggunakan perbandingan eluen yang berbeda dari

perbandingan eluen yang non polar hingga perbandingan eluen polar,

namun perbedaan tingkat kepolaran hanya sedikit antara satu dengan

yang lainnya .

Digunakan tiga eluen yang perbedaan tingkat kepolarannya berbeda

sedikit ini agar bisa dilihat pergerakan noda atau hasil dari elusinya,

apakah noda yang ingin dibuktikan tunggal atau tidak bisa dilihat

kenaikannya sedikit demi sedikit sehingga jelas hasilnya, Karena itu dipilih

perbandingan eluen non polar ke polar. Eluen yang dipilih tidak boleh

memiliki tingkat kepolaran yang jauh apa lagi kalau eluen kedua atau

ketiga melebihi kepolaran yang digunakan pada KLTP. Eluen-eluen

tersebut tidak boleh memiliki kepolaran yang lebih tinggi dari KLTP, harus

berdekatan sehingga noda pun terlihat jelas. Setelah terelusi dengan

menggunakan ketiga eluen dari non polar hingga polar, dilihat

penampakan nodanya pada UV 254 dan 366, noda yang telah ditotol

berada ditengah.

Untuk KLT dua dimensi, disiapkan alat dan bahannya, dilarutkan

ekstrak dengan kloroform, lalu ditotolkan pada lempeng yang sudah

diaktifkan dibuat perbandingan eluen. Kemudian dielusi hingga batas atas,

setelah mencapai batas atas keluarkan dan keringkan. Setelah itu putar

90° dan masukkan kembali lempeng kedalam chamber dengan

menggunakan perbandingan eluen kedua, setelah mencapai batas atas

keluarkan dan keringkan. Lihat noda yang tampak pada UV 254 dan 366.

Fungsi dari diputarnya 90° agar pita pemisahan dari hasil elusi

pertama terletak pada bagian bawah lempeng dengan tujuan agar pada

saat elusi yang kedua diperoleh pemisahan pita dengan arah yang

berbeda dari pemisahan pertama. Fungsi lain dari diputarnya 90° agar

hasil elusi yang pertama menjadi titik awal pengelusian untuk yang kedua.

Jika pada pengamatan menunjukkan dari kedua kali proses elusi yang

dilakukan terdapat satu bercak tunggal, maka dapat dikatakan bahwa

bercak tersebut merupakan senyawa tunggal.

Pada dasarnya sentrifuge dilakukan untuk memisahkan senyawa

yang terkandung dalam ekstrak, sentrifuge juga dilakukan untuk

memisahkan senyawa-senyawa dari bahan-bahan pencamar yang

terdapat dalam sampel yang dapat mempengaruhi hasil elusi.

 Untuk tahap pemurnian seperti yang telah diketahui digunakan

pelarut metanol PA dan kloroform PA karena kedua pelarut ini merupakan

pelarut yang murni bebas dari pengotor. Untuk menentukan senyawa

tunggal pada metode dua dimensi harus menggunakan pelarut dengan

kemurnian tinggi dan bebas dari pengotor yang dapat mempengaruhi hasil

elusi, dan kedua pelarut ini lebih sering digunakan untuk penelitian.
 BAB V

PENUTUP

V.1. Kesimpulan

Penggunaan kromatografi lapis tipis multi eluen dan kromatografi

lapis tipis dua dimensi digunakan untuk pemisahan beberapa senyawa

dengan karakteristik kimia dan nilai Rf yang hampir sama dengan

pemisahan analit berdasarkan perbedaan polaritas masing-masing.

Dari hasil sentrifuge sampel spons Cliona vastifica dilakukan

kromatografi lapis tipis multi eluen dengan perbandingan eluen MeOH :

Etil ( 3 : 1) dan diperoleh pita berwarna coklat.

V.2. Saran

Alat dan bahan dilengkapkan

 DAFTAR PUSTAKA

1. Ibnu Gholib Gandjar. Abdul Rahman.2008. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka

Pelajar : Yogyakarta.

2. Thin-Layer Chromatography. E-book.

3. isjd.pdii.lipi.go.id/admin/jurnal/91094854.pdf/ diakses 24 november

2011

4. rgmaisyah.files.wordpress.com/2009/10/jurnal KLT-fito.pdf/diakses 10

november 2009

5. Feist P. 2010. TLC - Retention Factor (Rf). [terhubung berkala]

http://orgchem.colorado.edu/hndbksupport/TLC/TLCrf.html [15 Mei

2010].

6. Lipsy P. 2010. Thin Layer Chromatography Characterization of the

Active Ingredients in Excedrin and Anacin. USA: Department of

Chemistry and Chemical Biology, Stevens Institute of Technology.

7. Jurnal penelitian isolasi dan identifikasi komponen kimia, pdf. Diakses

maret 2008.