1.1.

Uji Kemurnian

Pada tahap isolasi piperin dari buah lada hitam (piper nigrum) setelah
diperoleh isolat dilakukan tahap uji kemurnian dan tahap karakterisasi isolat.
Tahap uji kemurnian dilukan dengan menggunakan metode KLT
pengembangan tunggal dan KLT dua dimensi. Tahap karakterisasi isolat
dilakukan dengan menggunakan spektrofotometri UV VIS. Uji kemurnian
dilakukan untuk memastikan bahwa isolat yang didapatkan telah murni dari
pengotor. KLT pengembangann tunggal dilakukan untuk senyawa target yang
rumit dan KLT dua arah atau dua dimensi ini bertujuan untuk meningkatkan
resolusi sampel ketika komponen-komponen solute mempunyai karakteristik
kimia yang hampir sama, karenanya nilai Rf juga hampir sama sebagai mana
dalam asam-asam amino. Selain itu, 2 sistem fase gerak yang sangat berbeda
dapat digunakan secara berurutan sehingga memungkinkan untuk melakukan
pemisahan analit yang mempunyai tingkat polaritas yang berbeda (Gholib,
2008).
Tujuan dari KLT 2 dimensi adalah untuk menguji kemurnian dari suatu
senyawa dimana hanya ada satu noda yang terlihat ketika dilakukan
pengamatan pada lampu UV baik UV 254 dan UV 366. Karena senyawa target
yang akan diisolasi adalah piperin, piperin termasuk kedalam golongan
senyawa alkaloid dimana golongan alkaloid adalah golongan senyawa yang
dapat mengkristal namun pada praktikum ini piperin yang didapatkan tidak
mengkristal. Dikarenakan pada praktikum ini piperin tidak dapay mengkristal
jadi tidak dilakukan pengujian titik leleh. Pengujian titik leleh digunakan untuk
uji kemurnian dimana senyawa murni yang bebas dari pengotor maka rentang
titik lelehnya adalah ≤ 2˚C. Pelebaran rentang temperatur di atas 5˚C
mengindikasikan kristal kurang murni. Kontaminan megacaukan kosistensi dan
bentuk ikatan kristal pada level molekuler. Gangguan tersebut melemahkan
struktur ikatan lebih mudah terurai sehingga batas bawah temperatur turun dan
rentang temperatur menjadi melebar. Titik lebur piperin secara teoritis adalah
adalah 128-130˚C (Adosraku, et al., 2013).
 Pada tahap uji kemurnian KLT tunggal dan KLT 2D terlebih dahulu plat
diberi garis dengan menggunakan pensil secara tipis yang bertujuan untuk
menandakan tempat berhentinya elusi dan tempat penotolan spot untuk sampel
dan selanjutnya diaktivasi dengan cara disimpan kedalam oven selama 15
menit, hal ini bertujuan untuk menghilangkan molekul air yang mungkin terikat
didalam silika gel yang terdapat pada plat. Setelah itu dilakukan persiapam
penjenuhan eluen, eluen yang digunakan untuk KLT pengembangan tunggal
yaitu terdapat 3 eluen mulai dari non polar-semi polar-polar. Untuk eluen non
polar digunakan n-heksana, lalu untuk eluen semi polar digunakan etil asetat
dan untuk eluen polar digunakan metanol. Setelah itu ketiga eluen didalam
chamber dijenuhkan dengan bantuan kertas saring dimana kertas saring sebagai
indikator saja, kertas saring yang basah menunjuukan chamber sudah jenuh.
Tujuan penjenuhan chamber adalah agar proses elusi dapat berlangsung dengan
cepat. Setelah itu dilakukan penotolan isolat pada plat yang telah diaktivasi,
isolat diambil dari hasil KLT preparatif dari kerokan pita yang berwarna. Isolat
ditotolkan pada 3 plat yang kemudian dielusi dalam chamber yang berisi eluen,
tiap chamber mengelusi 1 plat yang telah di totolkan isolat. Setelah plat
dimasukan kedalam chamber lalu dielusi sampai tanda batas selanjutnya
diamati bercak dibawah sinar UV karena bercak tidak bisa dilhat dengan mata
telanjang dikarena senyawa targer piperin yang tidak memiliki ikatan rangkap
terkonjugasi yang cukup banyak sehingga sulit untuk dilihat dalam cahaya
tampak.
Berikut ini merupakan struktur piperin:

Maka dari itu diamati dibawah lampu UV 254 dan 266.

Hasil pengamatan yang diperoleh pada saat setelah diamati dibawah lampu
UV 254 dan 266. Bercak isolat mendapatkan hasil yang relatif sama dimana
saat menggunakan eluen n-heksana yaitu eluen yang sifatnya tidak polar,
bercak tidak naik atau tertahan dibagian bawah. Hal ini terjadi karena fase
gerak yang kurang polar sehingga tidak dapat membuat isolat terelusi. Hasil
pengamatan pada plat yang menggunakan eluen etil asetat yaitu eluen yang
sifatnya semi polar, bercak terelusi keatas tetapi terdapat tailing dan bercak
melebar hal ini menandakan masih adanya pengotor pada isolat. Hasil
pengamtan pada plat yang menggunakan eluen metanol yaitu eluen yang
sifatnya polar, bercak terelusi keatas dan terdapat satu bercak yang
menandakan isolat sudah murni. Hal ini sesuai dengan literatur bahwa senyawa
target yaitu piperin yang sifatnya polar akan terlihat pada eluen yang bersifat
polar pula yaitu pada eluen metanol yang bersifat polar.

Pada KLT 2 dimensi yang pertama dilakukan yaitu isolat ditotolkan pada
plat KLT. Kemudian dielusi dengan 2 sistem pengembang yang berbeda yakni
n-heksana: etil asetat (7:2) dan heksana: etil asetat (2:7). Pertama plat KLT
dikembangan dengan campuran eluen yang pertama kemudian setelah proses
elusi selesai diangkat plat dari chamber dan diamati bercak pada sinar UV 254
dan 366, kemudian plat dimasukkan kedalam chamber kedua tetapi posisinya
diputar 90˚ kearah kiri sehingga bercak yang terpisah pada pengembangan
pertama terletak dibagian bawah sepanjang lempeng, lalu dielusi kembali
(Gholib, 2008). Hasil pengamatan KLT 2 dimensi menunjukkan untuk kedua
isolat berupa satu spot yang menunjukkan piperin sudah murni tanpa pengotor,
tetapi masih ada sedikit tailing yang mandakan isolate masih sedikit ada
pengotor, hal ini bisa saja terjadi karena isolat belum sepenuhnya murni atau
pengotor berasal dari eluen/plat. Karena isolat dikatakan sudah benar-benar
murni jika memang hanya ada satu spot pada plat setelah dielusi dua kali pada
eluen berbeda dan isolat disimpulkan sudah benar-benar murni jika hanya
terdapat satu spot dan tidak terdapat tailing.
Setelah dilakukan uji kemurnian isolat pada KLT pengembangan tunggal
dan KLT dua dimensi, selanjutnya dilakukan uji kemurnian dengan
menggunakan spektrofotometri UV-Vis pada isolat. Spektrofotometri UV-Vis
adalah pengukuran serapan cahaya di daerah ultraviolet (200-350 nm) dan sinar
tampak (350-800nm) oleh suatu senyawa, alat yang digunakan adalah
spektrofotometer yang berfungsi untuk menentukan suatu senyawa baik secara
kuantitatif maupun kualitatif dengan mengukur trasmitan ataupun absorban
dari suatu cuplikan sebagai konsentrasi (Harjadi,1990).
Prinsip kerja dari spektrofotometri berdasarkan hukum Lambert Beer yaitu
apabila cahaya monokromatik (Lo) melalui suatu media (larutan), maka
sebagian cahaya tersebut diserap (La), sebagian dipantulkan (Ir), dan sebagian
lagi dipancarkan (Lt). Pengukuran adsorbansi tidak boleh terlalu encer karena
harus memenuhi ketentuan hukum Lambert – Beer. Hukum ini berlaku dengan
baik bila larutanya tidak terlalu encer ataupun pekat karena dapat menimbulkan
kesalahan fotomerik normal pada saat pemakaian spektrofotometri. Prinisp
kerja spektrofotometri adalah interaksi yang terjadi antara energi yang berupa
sinar dengan materi yang berupa molekul. Besar energi yang diserap dapat
menyebabkan elektron tereksitasi dari ground state ke keadaan tereksitasi yang
memiliki energi yang lebih tinggi. Serapan tidak terjadi seketika pada daerah
ultraviolet-visible untuk semua struktur elektronik tetapi hanya pada sistem-
sistem terkonjugasi, struktur elektronik dengan adanya ikatan p dan non
bonding elektron (Harjadi, 1990).
Uji kemurnian dengan menggunakan spektrofotometri UV Vis didapatkan
hasil pengamatan sesuai percobaan yaitu panjang gelombang 342 nm dan nilai
absorbansi 0,783. Pada saat dilakukan percobaan yang pertama diperoleh nilai
absorbansi terlalu tinggi karena isolat terlalu pekat dan tidak diencerkan
terlebih dahulu, karena hal itu dilakukan kembali uji kemurnian dengan
menggunakan spektrofotometri UV Vis dan isolat diencerkan terlebih dahulu
dengan menggunakan metanol. Setelah itu diperoleh hasil pengamatan
sebagaimana telah disebutkan diatas. Nilai absorbansi yang baik yaitu pada
rentang 0,2 – 0,8 dan hasil pengamatan yang kami peroleh adalah 0,783 hal ini
menunjukan nilai absorbansi kami masuk pada rentang nilai absorbansi yang
baik namun pada hasil spektrofotometri UV Vis yang seharusnya menunjukan
satu puncak pada grafiknya karena isolat dapat dikatakan sudah murni jika
hasil grafik menunjukan satu puncak. Pada hasil pengamatan yang kami
peroleh sesuai dengan yang terlampir masih terdapat puncak-puncak lain yang
menujukan masih terdapat pengotor, tetapi pengotor dapat muncul karena
faktor metanol yang digunakan. Karena seharusnya metanol yang digunakan
adalah metanol analitik tetapi karena di lab tidak tersedia, maka tidak
menggunakan metanol tersebut. Hal ini dapat menjadi faktor mengapa
munculnya puncak-puncak lain pada grafik.
gelombang piperin menurut Vishnath (2011) adalah 342 nm sedangkan
hasil percobaan kami adalah 342 nm, ini menunjukkan bahwa senyawa yang
kita ambil memang benar piperin . Nilai panjang gelombang ini bisa digunakan
juga untuk menuntukkan rumus kimia suatu senyawa.