Uji kemurnian dilakukan untuk memastikan bahwa isolat yang didapatkan telah
murni dari pengotor sehingga tidak mengganggu analisis lain yang akan dilakukan
selanjutnya. Perbedannnya dengan uji pemurnian adalah, pada uji pemurnian senyawa
yang dihasilkan masih belum murni maka pada tahap ini dimurnikan sedangkan uji
kemurnian digunakan untuk memastikan senyawa sudah murni dari pengotor. Uji
kemurnian yang dilakukan pada praktikum ini adalah KLT (pengembangan tunggal dan
dua dimensi) dan spektrofotometri UV VIS.
KLT pengembangan tunggal dilakukan jika senyawa target tidak rumit. KLT 2 arah
atau 2 dimensi bertujuan untuk meningkatkan resolusi sampel ketika komponen-
komponen solut mempunyai karakteristik kimia yang hampir sama, karenanya nilai Rf
juga hampir sama. Selain itu, sistem fase gerak yang sangat berbeda dapat digunakan
secara berurutan sehingga memungkinkan untuk melakukan pemisahan analit yang
mempunyai tingkat polaritas yang berbeda (Gholib 2008).
Pada Uji kemurnian baik KLT tunggal maupun KLT 2D terlebih dahulu plat
diaktivasi dengan cara disimpan kedalam oven dengan tujuan menghilangkan molekul
air yang mungkin terikat didalam silika gel yang terdapat pada plat. Kemudian
disiapkan eluen yang dimasukan kedalam chamber. Pada KLT pengembangan tunggal
digunakan 3 eluen dengan kepolaran berbeda yakni n-heksana (non polar), etil asetat
(semi polar), dan methanol (polar). Chamber dijenuhkan terlebih dahulu dengan
bantuan kertas saring dimana kertas saring yang basah menunjuukan chamber sudah
jenuh. Tujuan penjenuhan chamber adalah agar proses elusi dapat berlangsung dengan
cepat. Kemudian keatas plat KLT yang sudah diaktivasi ditotolakn isolat menggunakn
pipa kapiler. Dalam hal ini dikarenakan terdapat 2 pita hasil kromatografi preparatif
maka didapatkan 2 isolat yang berbeda. Masing-masing isolat ditotolkan keatas plat
KLT sebanyak masing-masing 3 totolan. Ditotolakan sebanyak 3 totoalan agar hasil
bercak yang nanti didapatkan dapat jelas terlihat. Kemudiaan plat KLT dimasukkan
kedalam chamber yang sudah jenuh dan dibiarkan dielusi sampai tanda batas atas.
Kemudian diamati bercak yang dihasillkan dibawah sinar UV. Spot tidak dapat dilihat
dengan mata telanjang. Hal ini dikarenakan struktut piperin yang tidak memiliki ikatan
rangkap terkonjugasi yang cukup banyak sehingga sulit untuk dilihat dalam cahaya
tampak
Oleh karena itu perlu digunakan alat bantu berupa lampu UV 254 dan 266. Silikagel
akan berpendar sedangkan sampel akan menjadi black spot yang
menutupi pendaran dari silika gel.
Hasil pengamatan KLT pengembangan tunggal untuk kedua isolat mendapatkan
hasil yang relatif sama dimana saat menggunakan eluen n-heksana bercak tidak naik
atau tertahan dibagian bawah. Hal ini terjadi karena fase gerak yang kurang polar. Saat
menggunakan eluen etilasetat bercak naik dan menghasilkan 4 spot sedangkan saat
menggunakan eluen methanol yang bersifat polar didapatkan satu spot yang
menunjukkan senyawa sudah murni. Hal ini sudah sesuai dengan literatur dimana
piperin yang merupakan senyawa target merupakan senyawa bersifat polar sehingga
akan terlihat pada eluen yang bersifat lebih polar.
Pada KLT 2 dimensi pertama-tama isolat ditotolkan pada plat KLT. Kemudian
dielusi dengan 2 sistem pengembang yang berbeda yakni n-heksana: etil asetat (7:2)
dan heksana: etil asetat (2:7). Pertama plat KLT dikembangan dengan campuran eluen
yang pertama kemudian setelah proses elusi selesai diangkat plat dari chamber dan
diamati bercak pada sinar UV 254 dan 366 kemudian plat dimasukkan kedalam
chamber kedua tetapi posisinya diputar 90˚ kearah kanan sehingga bercak yang terpisah
pada pengembangan pertama terletak dibagian bawah sepanjang lempeng, lalu dielusi
kembali (Gholib, 2008). Hasil pengamatan KLT 2 dimensi menunjukkan untuk kedua
isolat berupa satu spot yang menunjukkan piperin sudah murni tanpa pengotor.
KLT 2 dimensi dan KLT Tunggal dapat dinyatakan murni apabila isolat yang
berelusi hasil akhir nya memiliki satu bercak saja yang menandakan bahwa hanya
terdapat satu senyawa didalam isolat tanpa adanya pengotor yang memungkinkan
untuk mengganggu. Berdasarkan percobaan ini isolat piperin dari biji lada hitam
didapatkan isolat yang murni ditandai dengan hasil KLT 2D memiliki satu totol atau
satu bercak, sedangkan dalam KLT tunggal didapatkan totol/bercak berjumlah satu
pada eluen methanol.
Piperin termasuk kedalam golongan senyawa alkaloid dimana golongan alkaloid
adalah golongan senyawa yang dapat mengkristal namun pada praktikum ini piperin
yang didapatkan tidak mengkristal. Pada praktikum ini tidak dilakukan pengujian titik
leleh karena hasil dari isolat yang didapatkan tidak terdapat kristal didalamnya
sehingga pengujian kemurnian hanya dilihat berdasarkan pada hasil KLT baik tunggal
maupun 2 dimensi. Pengujian titik leleh digunakan untuk uji kemurnian dimana
senyawa murni yang bebas dari pengotor maka rentang titik lelehnya adalah ≤ 2˚C.
Pelebaran rentang temperatur di atas 5˚C mengindikasikan kristal kurang murni.
Kontaminan megacaukan kosistensi dan bentuk ikatan kristal pada level molekuler.
Gangguan tersebut melemahkan struktur ikatan lebih mudah terurai sehingga batas
bawah temperatur turun dan rentang temperatur menjadi melebar. Titik lebur piperin
secara teoritis adalah adalah 128-130˚C (Adosraku, et al., 2013).
Setelah dipastikan isolat yang sudah murni, dilakukan spektrofotometri UV-Vis
pada isolat. Spektrofotometri UV-Vis adalah pengukuran serapan cahaya di daerah
ultraviolet (200-350 nm) dan sinar tampak (350-800nm) oleh suatu senyawa, alat yang
digunakan adalah spektrofotometer yang berfungsi untuk menentukan suatu senyawa
baik secara kuantitatif maupun kualitatif dengan mengukur trasmitan ataupun absorban
dari suatu cuplikan sebagai konsentrasi (Harjadi,1990). Adanya absorbansi maksimum
pada panjang gelombang lebih dari 250 nm menunjukkan bahwa senyawa memiliki
ikatan rangkap terkonjugasi sehingga dapat diketahui isolat mempunyi ikatan rangkap
terkonjugasi (kromoform) karena menunjukkan absorbansi maksimal pada panjang
gelombang 340 nm
Prinsip kerja dari spektrofotometri berdasarkan hukum Lambert Beer yaitu apabila
cahaya monokromatik (Lo) melalui suatu media (larutan), maka sebagian cahaya
tersebut diserap (La), sebagian dipantulkan (Ir), dan sebagian lagi dipancarkan (Lt).
Pengukuran adsorbansi tidak boleh terlalu encer karena harus memenuhi ketentuan
hukum Lambert – Beer. Hukum ini berlaku dengan baik bila larutanya tidak terlalu
encer ataupun pekat karena dapat menimbulkan kesalahan fotomerik normal pada saat
pemakaian spektrofotometri.
Setelah dilakukan pengamatan, dihasilkan data sebagai berikut :
Pita Panjang gelombang Absrobansi
1. 340 nm 0,374
Sebenarnya terdapat 2 pita hasil dari kromatografi preparatif namun pada pita 2
didapatkan nilai absorbansi yang terlalu tinggi sehingga tidak dicantumkan. Hal ini
mungkin terjadi karena pada pita 2 sifat larutan terlalu pekat sehingga seharusnya
diencerkan terlebih dahulu. Sedangkan pada pita 1 langsung menunjukkan nilai yang
sesuai dengan literatur dimana panjang gelombang piperin menurut Vishnath (2011)
adalah 342 nm sedangkan hasil percobaan kami adalah 340 nm, ini menunjukkan
bahwa senyawa yang kita ambil memang benar piperin tanpa adanya senyawa
pengotor. Nilai panjang gelombang ini bisa digunakan juga untuk menuntukkan rumus
kimia suatu senyawa.
Adosraku, R K., James, O K., Isaac, Y A, (2013), Characterization And HPLC
Quantification Of Piperine Isolated From Piper Guineense (Fam.
Piperaceae), International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical
Sciences, Vol 5, Issue 1, 2013 ISSN- 0975-1491.
Gholib. 2008. Uji Daya Hambat Ekstrak Etanol Jahe Merah (Zingiber officinale var.
rubrum) dan Jahe Putih (Zingiber officinale var. amarum) Terhadap
Trichophyton mentagrophytes dan Cryptococcus neoformans. Prosiding
Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner. Bogor.
Harjadi, W. 1990. Ilmu Kimia Analitik Dasar. Jakarta : Penerbit Gramedia.
Rohman, A., 2009. Kromatografi Untuk Analisis Obat, Edisi Ke-1. Graha Ilmu:
Yogyakarta.
Vishvnath, G., & Jain, U. K., 2011, Quantitative Analysis of Piperine in Ayurvedic
formulation by UV Spectrophotometry, Int J Pharm Sci Res (IJPSR), 2, 58-
61
