Prosedur selanjutnya yaitu uji kualitatif penentuan adanya rhodamin dalam

blush on dengan menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT). Alasan penggunaan

KLT yaitu karena prosesnya sederhana, cepat, dan dapat dilakukan hampir
disemua Laboratorium dan ketepatan penentuan adanya suatu komponen akan
lebih baik karena komponen yang akan ditentukan merupakan bercak yang tidak
bergerak.
Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu analisis kualitatif dari suatu
sampel

yang

ingin

dideteksi

dengan

memisahkan

komponen-

komponen sampel berdasarkan perbedaan kepolaran dan adsorpsi. KLT dapat

digunakan untuk pemisahan senyawa yang berbeda seperti senyawa organik alam senyawa
organik sintetik,kompleks anorganik-organik dan bahkan ion anorganik,dapat dilakukan dalam
beberapa menit dengan alat yang harganya tidak terlalu mahal.
Pertama-tama disiapkan 3 jenis larutan yang akan ditotolkan pada pelat
KLT. Hal yang pertama dilakukan adalah pembuatan larutan baku rhodamin BPFI
(Baku Pembanding Farmakope Indonesia) dan sampel blush on. Larutan baku
dibuat dengan menimbang 5 mg baku rhodamin-B BPFI dan dilarutkan dalam
etanol 50 ml. Menggunakan etanol karena rhodamin B menurut Farmakope
Indonesia sangat mudah larut dalam etanol dan dibuat sampel yang telah
diekstraksi. Tujuan penggunaa larutan baku digunakan pada pelat KLT adalah
untuk membandingkan hasil Rf yang terbentuk pada sampel dengan Rf yang
dibentuk oleh larutan baku sehingga dapat menentukan ada atau tidak adanya
kandungan rhodamin B dalam sampel.
Kemudian dilakukan penyiapan fasa diam dan fasa gerak dari sistem
kromatografi lais tipis ini. Sistem dari KLT ini adalah normal phase dimana fasa
gerak yaitu silica gel bersifat polar dan fasa gerak bersifat lebih non polar. Fasa
gerak yang digunakan merupakan campuran dari n-butanol,etil asetat,dan amoniak
(55:20:25). Fasa diam adalah fasa yang terikat pada pendukung, fase diam yang
digunakan pada percobaan kali ini yaitu silika gel GF 254. Silika gel adalah
adsorben yang paling luas penggunaannya baik pada kromatografi kolom maupun
KLT. Silika gel [(SiO2)x] mempunyai atom oksigen yang polar dan adanya gugus

hidroksi pada permukaannya menjadikan silika gel bahan yang benar-benar polar.
Sehingga akan menarik molekul polar daripada molekul nonpolar Silika gel
disiapkan dengan asidifikasi Natrium silikat menggunakan asam sulfat yang
diikuti dengan pencucian menggunakan air dan pengeringan/ pembebasan air
karena jika silika gel mengandung molekul air, maka akan terjadi partisi dan
bukan adsorpsi. Pengecilan ukuran partikel akan meningkatkan luas area dan akan
meningkatkan daya pemisahan.arti dari G nya merupakan Gypsum(kalium sulfat)
yang berperan untuk memperkuat pelapisannya pada pendukung yang digunakan,
pada praktikum kali ini digunakan kaca sebagai pendukung. Arti dari F254 yatu
ditambahkan zat berpendar/ indikator berflouresensi di lampu ultraviolet dengan
panjang gelombang 254 nm. Sedangkan fasa gerak adalah fasa yang bergerak
melalui fasa diam. Fase gerak yang digunakan yaitu etanol : etil asetat : air ( 40 :
20 : 15) sebanyak 100 ml, penggunaan pengembang tersebut karena Rhodamin B
bersifat polar sehingga diharapkan dapat tertarik dengan menggunakan fase gerak
yang lebih polar. Lalu fase gerak dimasukkan dalam chamber yang telah
dioleskan vaselin pada permukaan tutup atas chamber yang bertujuan untuk
mengedapkan udara didalam chamber agar tidak ada udara dari luar yang masuk
ke dalam chamber yang dapat menggangu proses penjenuhan pengembang
sehingga hasil KLT yang diperoleh tidak maksimal. Tinggi campuran pelarut
dalam bejana disesuaikan dengan plat klt 16 x 20 cm yang mana titik awal plat klt
tidak boleh terendam dalam campuran pelarut tersebut karena bila titik awal
tercelup pada pengembangan akan menyebabkan senyawa kimia dari titik pertama
akan terlarut lebih dahulu pada larutan pengembang sebelum dilakukan
pemisahan.Tujuan

penjenuhan

yaitu

supaya

larutan

pengembang

yang

dimasukkan ke dalam chamber mengalami penguapan namun tidak dapat keluar

dari chamber sehingga diperoleh suasana yang jenuh. Pada suasana jenuh ini
penguapan dari larutan pengembang akan menghasilkan tekanan ke atas. Keadaan
inilah dimanfaatkan untuk melajukan larutan pengembang, kemudian penjenuhan
fase gerak juga dilakukan untuk meningkatkan efektivitas dari pemisahan pada
kromatografi lapis tipis. Ketidakjenuhan bejana akan mengakibatkan beberapa
masalah seperti speading spot, tailing dan ketidaktepatan Rf.

Selanjutnya diatas pelat silika yang telah disiapkan ditotolkan larutanbaku

dan larutan sampel pada plat dengan jarak antar titik 2,5 cm supaya spot yang ada
tidak saling tumang tindih atau saling menumpuk sehingga akan mengacaukan
hasil Rf. Sebelum mentotolkan sampel ke plat KLT, terlebih dahulu dibuat batas
atas dan batas bawah dengan menggunakan pensil, hal ini bertujuan agar kita
mengetahui dimana pentetesan sampel itu. Dalam penandaan tidak digunakan
tinta karena pewarna dari tinta akan bergerak selayaknya kromatogram dibentuk.
Hal ini dapat mempengaruhi proses pengelusian senyawa sample. Pertama-tama
pada plat dibuat garis 1 cm dari masing-masing ujung dengan menggunakan
pensil. Pensil dipilih dari pada alat tulis dengan tinta karena tinta dapat
mengganggu hasil karena akan terbawa bersama fase gerak. Titik tempat
ditempatkan disebut titik awal. Larutan sampel dan baku diletakkan pada titik
awal dengan menotolkan menggunakan pipa kapiler sebanyak 3-5 kali pada titik
yang sama sampai jenuh dan diusahakan agar luas totolan sekecil mungkin.
Jumlah totolan tidak boleh terlalu banyak karena menyebabkan bercak menjadi
asimetris dan menyebabkan perubahan pada harga Rf . Selain itu penotolan harus
tepat sehingga didapatkan jumlah noda yang baik. Penotolan cuplikan merupakan
tahap yang paling menentukan pada KLT. Pemisahan pada kromatografi lapis tipis
yang optimal akan diperoleh hanya jika menotolkan sampel dengan ukuran sekecil
dan sesempit mungkin. Jika sampel ditotolkan terlalu banyak maka akan
menurunkan resolusi. Penotolan yang tidak tepat akan menyebarkan bercak yang
menyebar dan puncak ganda dan jika penotolan terlalu sedikit maka spot yang
teramati tidak akan jelas. Kemudian lempeng KLT dimasukkan ke dalam chamber
yang berisi fase gerak yang telah jenuh. Ketika pelarut mulai membasahi plat /
lempengan, pelarut pertama-tama akan melarutkan senyawa-senyawa dalam
bercak yang telah ditempatkan pada garis dasar. Senyawa-senyawa akan
cenderung

bergerak

pada

lempengan

kromatografi

sebagaimana

halnya

pergerakan pelarut. Senyawa yang bersifat polar akan ikut tertarik oleh
pengembang, karena eluen yang digunakan memiliki kepolaran yang lebih tinggi
daripada silika sehingga ikatan Rhodamin B dengan silika lebih kecil daripada

ikatan Rhodamin B dengan eluen sehingga akibatnya Rhodamin B akan berada

pada jarak mendekati fase gerak.
Pemisahan pada kromatografi lapis tipis dilakukan sampai eluen mencapai
garis akhir pelarut. Setelah pengembang sampai pada garis akhir pada pelat, pelat
diangkat dan didiamkan hingga kering. Lalu diukur nilai Rf (factor), nilai Rf
menyatakan ukuran daya pisah suatu zat dengan KLT, dimana jika nilai Rfnya
besar berarti daya pisah zat yang dilakukan solvent (eluennya) maksimum
sedangkan jika nilai Rfnya kecil berarti daya pisah zat yang dilakukan solvent
(eluenya) minimum. Nilai Rf untuk setiap warna dihitung dengan rumus sebagai
berikut:
Rf =

jarak yang ditempuh oleh komponen

jarak yang ditempuh oleh pelarut

Dari hasil percobaan ini didapatkan Rf larutan baku Rhodamin-B BPFI

yaitu 0,89 dan RF larutan sampel 0,84 yang menunjukan bahwa sampel teikat
dengan eluen sehingga mendekati laju fase gerak. RF baku dengan sampel
tersebut hampir mirip sehingga dapat dikatakan dalam sampel tersebut
mengandung Rhodamin B.