KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)

Thin Layer Chromatography (TLC)

 dikembangkan oleh Egon Stahl
 merupakan kromatografi serapan atau
kromatografi partisi
1. Pengertian KLT
2. Kegunaan KLT :
ada 2 : a. kuali, kuanti, preparatif
b. penjajakan sistem pelarut
 Keuntungan KLT

Banyak digunakan karena :

 sederhana, mudah difahami secara teknik
 waktu analisis relatif pendek, dpt diulangi
setiap saat
 Ekonomis
 daya pisah cukup baik
Dibandingkan dengan HPLC dan GC, TLC
mempunyai beberapa keuntungan, yaitu:
1. KLT memberikan fleksibilitas yang lebih besar,
dalam hal memilih fase gerak.

2. dapat dilakukan pemisahan seperti

pengembangan 2 dimensi, pengembangan
bertingkat,

3. Proses kromatografi dapat diikuti dengan

mudah dan dapat dihentikan kapan saja.

4. Semua komponen dalam sampel dapat

dideteksi.
 Fase diam
Fase diam (Stationary phase = sorbent = adsorbent =
penjerap):
1. Silika gel

- silika gel G  sbg pengikat digunakan gypsum

- silika gel S  sbg pengikat digunakan pati
- silika gel GF 254  ditambah gypsum dan senyawa
berpendar pada UV l 254 nm
- silika gel H, Silika gel N [ tanpa pengikat ]
- silika gel tanpa pengikat ttp dengan seny. berpendar
- silika gel untuk keperluan preparatif
2. Alumina
- alumina asam (pH 4), netral (pH 7), basa
(pH 9).
- Pemberian kode seperti silika gel G.H.P.F.
3. Selulosa :
- serat 2-20 m, serat asli (MN 300),
mikrokristal (Avicel) utk senyawa
polar. Dengan atau tanpa senyawa
fluorescence.
 FASE GERAK

Pelarut yg sederhana yaitu campuran 2 pelarut

organik.

Petunjuk pemilihan fase gerak sbb:

a. Kemurnian sangat tinggi
b. Daya elusi fase gerak hrs diatur
c. Jk fase diam polar mk polaritas fase gerak
menentukan kecepatan migrasi solut
 Luminescence (berpendar)
Dibedakan : Fluorescence ( 10-8 detik)  seny organik
Phosphorescence ( > 10-8 detik ) seny anorganik
Indikator fluorescens organik  code F366, UV366
Contoh: - fluorescein dan garamnya
- rhodamin B dan rhodamin 6G
- morin, dll.
Indikator fosforesens anorganik kode F254, UV254
hijau kuningZn cadmium sulfida
biruseny timah strontium,
kuning uranil asetat,
hijau kuning  manggan zn silikat
kode F254s alkali tanah wolframat
 Pembuatan lapis tipis
Ada 4 macam cara :
1. Pembentangan
2. Penuangan
3. Penyemprotan
4. pencelupan
CARA PENUANGAN
Pembuatan Pelat (lempeng) silika gel
+ 30 gram silika gel + air (sejumlah tertentu) diaduk
homogen, tak lebih 4 menit dimasukkan alat perata
Stahl- Desaga atur ketebalan (0,25-2,0 mm).
Diratakan di atas 6 lembaran kaca (20x20 cm).
Keringkan di udara, kmd dimasukkan oven 100-
120oC selama 60 menit. Sejukkan dan simpan dlm
eksikator.
Untuk keperluan preparatif dibuat sendiri
Untuk keperluan analitik & preparatif  ada di
pasaran di atas lembaran kaca, plastik ataupun
aluminium.
bermacam ukuran 20 x 20 cm, 10 x 20 cm dll.
 Perbandingan fase diam dan cairan pembuatan pelat

Perbandingan
Fase diam Jenis cairan Fase diam:cairan
(g : ml)
1. Silika gel G/GF Air 30 : 60-65
2. Silika gel H Air 30 : 80-90
3. Alumina G Air 30 : 40
4. Alumina H Air 30 : 80-90
5 Kiselgur Air 30 : 60-65
Serbuk selulosa MN Air 1:5
300
Serbuk poliamid Kloroform : 1: 9
metanol=2:3
Penyiapan dan Penotolan Sampel
- Pelarut sampel yang sesuai
- 1-20 ml yang mengandung 50-100mg f 3-6mm
- Alat penotol : kapiler gelas, mycrosyringe
- overloaded  Rf berubah dan bercak tidak
simetri
Pengembangan (elusi)
- Bejana diisi fase gerak hingga kedalaman 0,5 cm 
jenuh
- Totolan (sdh kering) pada plate, dimasukkan bejana
- Totolan jangan tercelup fase gerak
- Batas yang dicapai gerak ditandai dg pensil lemah
- Didokumentasi profil kromatogramnya (Rf).
Macam Cara Pengembangan :
Pengembangan menaik (ascendent)
Pengembangan menurun (decendent)
Pengembangan mendatar
Pengembangan berulang
Pengembangan dua dimensi  Pemisahan senyawa flavone
‘Harbone’
Pengembangan sirkular  kromatotron

Pengamatan / mendeteksi / visualisasi bercak.

Secara langsung
Dengan perlakuan :
destruksi  Pereaksi semprot, uap I2  75%
tidak rusak
non-destruksi  UV lamp
Perhitungan nilai Rf
Nilai Rf untuk setiap warna dihitung
dengan rumus sebagai berikut:

Sebagai contoh, jika komponen

berwarna merah bergerak dari 1.7 cm
dari garis awal, sementara pelarut
berjarak 5.0 cm, sehingga nilai Rf
untuk komponen berwarna merah
menjadi:
ANALISIS SAMPEL YANG TIDAK BERWARNA
1.Menggunakan pendarflour

Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana

bercak pada kromatogram berada,
meskipun bercak-bercak itu tidak tampak
berwarna jika dilihat dengan mata.
Ketika sinar UV diberikan pada
lempengan, akan timbul pendaran dari
posisi yang berbeda dengan posisi
bercak-bercak. Bercak tampak sebagai
bidang kecil yang gelap.
ANALISIS SAMPEL YANG TIDAK BERWARNA
2. Penunjukkan bercak
secara kimia
 jarak yg ditempuh senyawa sampel
Rf :
Jarak yg ditempuh fase gerak

jarak yg ditempuh senyawa sampel

Rr :
jarak yg ditempuh senyawa pembanding

HRf : 100 x Rf

Rf = retardation factor
= ratio of front
= retention factor
DETEKSI BERCAK
1. Kimia dg penyemprotan
2. Fisika pencacahan radioaktif, fluoresensi
sinar UV
3. biologi

Cara – cara kimiawi untuk mendeteksi bercak :

1. Menyemprot lempeng KLT dg reagen kromogenik, kadang
lempeng dipanaskan dulu utk mempercepat reaksi
pembentukan warna dan intensitas warna bercak
2. Mengamati lempeng di bwh sinar UV pd λ emisi 254 dan 366
3. Menyemprot lempeng dg H2SO4 pkt/HNO3 pkt lalu
dipanaskan
4. Memaparkan lempeng dg uap iodium
5. Scanning lempeng dg densitometer
 KLT-KT (KINERJA TINGGI)
Maksudnya utk mendapatkan pemisahan dan hasil
analisis yg lebih baik dibanding KLT biasa

Keunggulan KLT-KT :
1. f. diam yg digunakan berukuran sgt halus dan porinya
seragam, tebal lapisan 0,1 mm
2. Jml Sampel hanya sedikit
3. Konsentrasi sampel kecil
4. Resolusi sudah nampak pd jarak pengembangan 3-6
cm
 Macam pereaksi warna (semprot) dan penggunaannya
Pereaksi Jenis Senyawa Warna

1. Anilina ftalat Gula mereduksi Berbagai warna

2. Anisaldehida dalam H2SO4, etanol, Karbohidrat Biru
dan bbrp tetes asam asetat
3. Stibium klorida dlm CHCl3 Steroid, lipid alifatik Berbagai warna
4. 2,4-dinitrofenilhidrazin dlm HCl Aldehida, keton Kuning  orange
5. Dragendorff Alkaloida,basa organik Jingga

6. Besi (III) klorida Fenol Berbagai warna

7. Ninhidrin Asam amino (kemerahan)
Biru
8. -DAB Sulfa Kuning-oranye
-Diazotasi kmd dg N-1-
naftiletilendiamin Merah

* Introduction of chromatography “ Roy J. Gritteeer et al

 Ada dua teori pada kromatografi
1. Teori pelat (Plate theory)  Martin, A.J.P. dan Synge, R.L.M.(1941)

Berkembang dari teori distilasi L

HETP = -----------
N
tR tR
2 atau N = 5,54 (--------) 2
N = 16 (-------)
Wb W 1/2

2. Teori kecepatan (rate theory)  Van Deemter, J.J

Untuk keperluan mencari sistim KLT selain mencoba-coba, ada
bbrp literatur yg dpt membantu. Mis. buku :
E.G.C.Clarke, Judith Berle, MSc. (1974) :Isolation and
Identification of drugs, The Pharmaceutical Press, London.
: - ada 22 sistem KLT  kode T1 sd T22.
- Tiap sistem  camp fase gerak tertentu untuk mengelusi gol obat tertentu
fase diam : silika gel dengan ukuran 20 x 20 cm.
Diberikan nilai Rfnya.
: -Untuk sistem Kromatografi kertas  kode P1 dan seterusnya

No Sistem Golongan Senyawa Obat

1. T1 Basa Nitrogen (alkaloid)
2. T2 Antihistamin & klordiazepoksida
3. T3 Anti histamin
4 T4 dst
10 T10 Barbiturat Fase gerak :
aseton 1bg
CHCl3 9 bg
Pengembangan : 10-17 cm
Visualisasi :
KMnO4  warna kuning, coklat, purple.
Pereaksi Zwikkers  warna Pink atau hijau

11 T11 Barbiturat -
12 T12 Barbiturat -Fase gerak : lart. Ammoniak pekat 5,
Benzen 75, dan dioksan.
22 T22 Golongan Sampel dilartkan dlm aseton.
sulfa Fase gerak : CHCl3 1, Etanol 1, Heptana 1
dan air 1,5%
Kesetimbangan : 3 jam
Visualisasi : diazotasi dengan N-1
naftiletilendiamin (spray).
 H
O N O
Fase gerak : T10
R1
N
aseton 1bg
H CHCl3 9 bg
R2
O

Nama Senyawa R1 R2 Rf
Barbital C 2H 5- C 2H 5- 0,22
(5,5-dietil as barbiturat)
Fenobarbital C 2H 5- 0,24
H3C
Probarbital C 2H 5- 0,24
HC
H3C

Siklobarbital C 2H 5- 0,32

CH3
Amilobarbital C 2H 5- CH2
0,33
C
H3 C H C
H2

H2
Butobarbital C 2H 5- C CH2 0,33
H3C C
H2
 Obat golongan Sulfa : Sistem T22
Fase gerak : CHCl3 1, Etanol 1, Heptana 1 dan air 1,5%

H2N SO2 NH R

Nama senyawa R Rf

Sulfadiazin N
( 2-sulfanilamidopyrimidin) 0,47
N

Sulfamerazin N

(2-sulfanilamido-4-metilpyrimidin)
N
0,57
CH3
Sulfadimidin CH3
N
(2-sulfanilamido-4,6-dimetil- 0,64
pyrimidin) N
CH3