PERCOBAAN 5 Analisis Kualitatif Metabolit Sekunder

I. Tujuan Praktikum Menganalisis hasil isolasi piperin, glukosa flavonoid, aglikon flavonoid, dan glikosida dengan metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan pereaksi warna

II. Alat dan Bahan Alat yang digunakan yaitu KLT, spektrofotogiavi UV, pipet, tabung reaksi, kertas saring, corong, beaker glass, penggaris, labu ukur, pipet ukur, filler. Dan pengangas uap. Bahan yang digunakan yaitu hasil isolasi piperin, hasil isolasi glikosida flavonoid, hasil isolasi aglikon, hasil isolasi glikosida, diklormetan, etilasetat, silika gel GF 254, piperin standar, pereaksi anisaldehid-asam sulfat, selulosa, asam asetat, ruti, metanol, pereaksi sitroborat n-butanol, air, larutan glukosa, larutan ramnosa, larutan kalium permanganat basa, amonia, kloroform, HCl, pereaksi dragendrof, pereaksi mayer, logam magnesium atau seng, amil alkohol, pereaksi besi (III) klorida, gelatin, eter, pereaksi Liebermann Burchad, dan KOH.

III. Skema Kerja A. Analisis Kualitatif I (hasil isolasi piperin)

Larutan kristal dalam etanol dan sari hasil penyaringan dengan soxhlet

Ditotolkan pada silika gel GF 254 sbg fase diam Dielusi dalam fase gerak dklormetan

Bercak pada silika gel GF 254

Diamati pada : a. Sinar tampak b. Sinar UV 254nm dan 366nm Disemprot pereaksi anisaldehid asam sulfat Dipanaskan 110oC selama 10 menit
RF

 Dihitung dan dibandingkan dengan Rf piperin standar

Hasil

B. Analisis Kualitatif II (hasil isolasi flavonoid)

Sari I Sari III Sari III

Ditotolkan pada selulosa sebagai fase diam Dielusi pada asam asetat sebagai fase gerak

Bercak pada selulosa

Diamati pada:a. Sinar UV 266 nm b.uapamoniak, sinar tampak c. uap amoniak, sinar366nm Disemprot pereaksi sitroborat Dipanaskan 110oC selama 5 menit Diamati dibawah UV 366nm

Rf dan warna yang terbentuk

Hasil

Dicatat, Dihitung

C. Reaksi Warna 1. Alkaloid

Ekstra k

Dibasakan oleh amonia Ditambahkan kloroform Digerus kuat Cairan Dipipet melalui kapas kedalam tabung reaksi Ditambah HCl 1 N
Fase air

Filtrat I

Filtrat II

Filtrat III

Ditambah 1 tetes pereaksi ragendrof

Endapan / keruhan berwarna coklat

ditambah 2 tetes pereaksi mayer

Endapan putih Blanko/kontrol negatif

Alkaloid Alkaloid

2. Flavanoid
Ekstrak

Ditambah sedikit air Ditambah logam magnesium / seng Ditambah HCl 2 N Dipanaskan selama 5-10 menit
Filtrat

Disaring ketika panas Didinginkan Ditambah amil alkohol dikocok

Warna merah Flavonoid

3. Tanin dan Polifenol

Ekstrak

Filtrat

Digerus dengan air Dididihkan Disaring

Filtrat I

Filtrat II

Ditetesi pereaksi besi (III) klorida

Warna biru hingga hitam

Ditetesi gelatin
Gumpalan

Tanin / polifenol Endapan gelatin

Disaring Ditetesi besi (III) klorida

Tanin / polifenol Warna hitam

4. Saponin
Ekstrak

Dilarutkan dengan air Dipanaskan Didinginkan Dikocok kuat selama beberapa menit
Busa setingg 1 cm Persisten selama 5-10 menit

Tidak hilang pada penambahan satu tetes larutan HCl 0,1 N Saponin

5. Triterpenoid dan steroid Ekstrak Digerus dengan eter

Fase air

Dipipet melaui penyaringan kapas Diuapkan hingga kering

Residu Ditetesi pereaksi Liebermann Burchad

Warna ungu Terpenoid

Warna hijau

Steroid

IV. Hasil Praktikum

A. Analisis Kualitatis hasil isolasi piperin Sinar UV Sinar UV 366 nm Harga Rf 0,9196 Harga HRf 91,9%

B. Analisis Kualitatif hasil isolasi sari I dan sari II Bahan Sari I Sari II Sari III Harga Rf 0,417 Harga Hrf 41,7% -

C. Reaksi warna Reaksi warna Alkaloid - Filtrat 1 A (ekstrak piperin + perekasi dragendorf) Coklat bening (-) Hasil

B ( Sari 1 ditambah dragendorf)

perekasi

Coklat bening (-) - Filtat 2 A(ekstrak piperin + Meyer) B (Sari 1 + perekasi Meyer) Coklat bening + (-) perekasi

Coklat bening ++ (-)

Flavonoid - Tabung 1 (Sari 1 ditambah serbuk tembaga +HCL 2N, dipanaskan + amil alkohol) - Tabung 1 (Piperin ditambah serbuk tembaga +HCL 2N, dipanaskan + amil alkohol) Keruh coklat (-)

Bening (-)

Tanin dan polifenol - Tabung 1( Sari 1 dipanaskan + FeCl3) - Tabung 2 (ekstrak piperin dipanaskan + FeCl3) Kuning bening (-)

Coklat tua (-)

Saponin - Tabung 1 (ekstrak piperin + air Kuning keruh (-)

dipanaskan + HCL 0,1 N) - Tabung 1 (Sari 1 + air dipanaskan + HCL 0,1 N) Triterpenoid dan steroid Tidak berwarna, ada busa (+) Tidak dilakukan karena pereaksi Liebermann Burchard habis

D. Gambar Gambar hasil bercak KLT piperin

Gambar untuk Reaksi warna Tanin:

Gambar untuk Rekasi warna Saponin

Gambar untuk perekasi alkaloid

Pereaksi Dragendorf Perekasi Mayer

V. Pembahasan Analisis kualitatif merupakan analisis untuk melakukan identifikasi elemen, spesies, dan atau senyawa-senyawa yang ada di dalam sampel. Dengan kata lain analisis kualitatif berkaitan dengan cara untuk mengetahui ada ataunya suatu analit yang dituju dalam suatu sampel. Analisis kuantitatif adalah analisis untuk menentukan jumlah (kadar) absolut atau relatif dari suatu elemen atau spesie yang ada di dalam sampel (Gandjar,2005). Kromatografi digunakan untuk memisahkan substansi campuran menjadi komponen-komponennya. Seluruh bentuk kromatografi berkerja berdasarkan prinsip ini. Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau kombinasi cairan-padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen yang terdapat dalam campuran. Komponen-komponen yang berbeda bergerak pada laju yang berbeda. Prinsip dasar kromatografi yaitu pemisahan komponen dari suatu campuran berdasarkan perbedaan migrasi dan distribusi komponen tersebut dalam dua fasa yang berbeda yakni fasa diam dan fasa bergerak. Fasa diam adalah fasa yang tidak bergerak, dapat berupa pa datan atau cairan yang terikat pada permukaan padatan (kertas atau suatu adsorben). Sedangkan fasa gerak adalah fasa yang bergerak melalui fasa diam dan membawa komponen- komponen senyawa yangdipisahkan, biasanya berupa cairan yang disebut eluen atau pelarut. Gerakan fasa gerak ini mengakibatkan

terjadinya migrasi diferensial komponen dalam sampel. Pada posisi yang berbeda- beda, senyawa- senyawa yang berbeda akan tertahan dan teradsorbsi pada fasa diam dan kemudian satu demi satu senyawa-senyawa tersebut akan terbawa kembali oleh fasa gerak yang melaluinya. Zat terlarut yang memiliki afinitas terhadap fasa gerak lebih besar akan tertahan l e b i h l a m a p a d a f a s a g e r a k s e d a n g k a n z a t t e r l a r u t y a n g m e m i l i k i a f i n i t a s terhadap fasa gerak lebih kecil akan tertahan lebih lama pada fasa diam. Dengan demikian senyawa- senyawa dapat dipisahkan komponen demi komponen akibat perbedaan migrasi di dalam fasa gerak dan fasa diam (DW, 2004) Pelaksaanan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras.Jel silika (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendarflour dalam sinar ultra violet, alasannya akan dibahas selanjutnya. Fase gerak merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai (Clark, 2007). Kromatografi kertas adalah salah satu pengembangan dari kromatografi partisi yang menggunakan kertas sebagai padatan pendukung fasa diam. Oleh karena itu disebut kromatografi kertas. Sebagai fasa diam adalah air yang teradsorpsi pada kertas dan sebagai larutan pengembang biasanya pelarut organik yang telah dijenuhkan dengan air (Clark, 2007). Kromatografi lapis tipis digunakan untuk pemisahan zat secara cepat dengan menggunakan zat penyerap berupa serbuk halus yang dilapiskan serba rata pada lempeng kaca. Lempeng yang dilapis, dapat dianggap sebagai kolom kromatografi terbuka dan pemisahan didasarkan pada penyerapan pembagian atau gabungannya tergantung dari jenis zat penyerap pembagian atau gabungannya tergantung dari jenis zat penyerap dan cara pembuatan lapisan zat penyerap dan jenis pelarut. KLT dengan penyerap penukar ion dapat digunakan untuk pemisahan senyawa polar. Harga Rf yang diperoleh pada KLT tidak tetap jika dibandingkan dengan yang diperoleh pada kromatografi kertas karena itu pada lempeng yang sama disamping kromatogram dari zat yang diperiksa perlu dibuat kromatogram dari zat pembanding kimia lebih baik dengan kadar yang berbeda-beda. Perkiraan

identifikasi diperoleh dengan pengamatan 2 bercak dengan harga Rf dan ukuran yang lebih kurang sama. Ukuran dan intensitas bercak dapat digunakan untuk memperkirakan kadar. Penetapan kadar yang lebih teliti dapat digunakan dengan cara densito metri atau dengan mengambil bercak dengan hati-hati dari lempeng, kemudian disari dengan pelarut yang cocok, dan ditetapkan dengan cara spektrofotometri. Pada percobaan yang pertama dilakukan uji kualitatif terhadap hasil isolasi piperin, perlakuan yang dilakukan pada percobaan tersebut dengan ditotolkan larutan kristal dalam etanol dan sari hasil penyaringan dengan soxhlet pada silika gel GF 254 yang berperan sebagai fase diam, kemudian di elusi dalam fase gerak (diklormetan ; etilasetat). Setelah selesai akan timbul bercak yang kemudian diamati dibawah sinar UV 366 nm didapatkan harga Rf sebesar 0,9196 dan harga HRf didapatkan sebesar 91,9%. Pada percobaan yang kedua dilakukan uji kualitatif hasil isolasi daun sirsak. Sari I,sari II, dan sari III ditotolkan pada selulosa sebagai fase diam, kemudian di elusi dalam fase gerak yaitu asam asetat 15% . Setelah selesai akan timbul bercak yang kemudian diamati dibawah sinar UV 366 nm didapatkan harga RF Untuk sari II sebesar 0,417 dan harga HRf didapatkan sebesar 41,7%. Pada sari I dan III tidak tampak bercak warna hal ini mungkin disebabkan pereaksi yang dipakai tidak sesuai dengan kandungan senyawa aktif pada sari I.

Pada percobaan kedua dilakukan reaksi warna terhadap kedua hasil isolasi. A. Hasil isolasi piperis albi 1. Uji Alkaloid Ekstrak yang didapat ditambahkan dengan amonia yang berfungsi untuk membasakan ekstrak tersebut. Kemudian ditambahkan kloroform dan dikocok dengan kuat sampai larutannya terlihat secara jelas terpisah. Pisahkan Cairan tersebut kemudian ditambah dengan HCl untuk menetralkan. Ambil fase air yang kemudian dipisahakan menjadi dua bagian. Hal ini dilakukan pada dua larutan yaitu ekstrak piperin dan sari I. Bagian pertama ; a. Ekstrak piperin ditambah dengan satu tetes pereaksi dragendorf, hasil yang diperoleh berwarna coklat bening dan tidak terbentuk

endapan. b. Sari I ditambah dengan pereaksi dragendorf, hasil yang diperoleh berwarna coklat bening dan tidak terbentuk endapan. Bagian kedua; a. Ekstrak piperin ditambah pereaksi mayer, hasil yang diperoleh berwarna coklat bening tidak terbentuk endapan putih. b. Sari I ditambah pereaksi mayer, hasil yang diperoleh berwarna coklat bening agak tua tidak terbentuk endapan putih Hasil isolasi piperis albi tidak mengandung alkaloid dengan pereaksi mayer maupun pereaksi dragendorf. 2. Uji Flavonoid Ekstrak ditambah dengan sedikit air kemudian ditambah logam magnesium atau seng, lalu ditambah dengan HCl 2 N yang kemudian dipanaskan selama beberapa menit. Filtrat yang didapat setelah pemanasan disaring ketika panas kemudian didinginkan dan ditambah amil alkohol kemudian dikocok. Proses ini dilakukan pada tabung 1 yaitu: sari I dan tabung 2 : ekstrak piperin. Warna yang timbul pada tabung 1 adalah bening, sedangkan tabung 2 berwarna keruh hal ini membuktikan bahwa hasil isolasi piperis albi tidak mengandung flavonoid yang seharusnya berwana merah. 3. Uji Tanin dan Polifenol Ekstrak digerus dengan air kemudian dididihkan beberapa menit mendapatkan filtrat. Filtrat ditetesi pereaksi besi (III) klorida. Proses ini dilakukan pada tabung 1 yaitu ekstrak piperin dan tabung 2 yaitu sari 1. Warna pada tabung 1 adalah coklat tua kehitaman hal ini menunjukkan hasil isolasi piperin mengandung tanin dan polifenol dan tabung 2 berwarna kuning bening yang menandakan sari 1 tidak mengandung tanin dan polifenol. 4. Uji Saponin Percobaan yang dilakukan mula-mula ekstrak dilumatkan dengan air lalu dipanaskan. Setelah dingin tabung dikocok selama beberapa menit. Bila terjadi busa setinggi minimal 1cm dan persisten selama 5-10 menit, serta tidak menghilang pada penambahan 1 tetes larutan HCl 0,1 N, menunjukan adanya senyawa saponin. Proses ini dilakukan pada tabung 1 yaitu ekstrak piperin dan tabung 2 sari 1. Pada tabung 1 berwarna kuning keruh dan tidak menghasilkan busa ini

menunjukkan bahwa ekstrak piperin tidak mengandung saponin, sean dangkan tabung 2 tidak berwarna dan menghasilkan busa. Hal ini sama dengan literatur yang menyebutkan bahwa piperin mengandung saponin.

VI. Kesimpulan - Hasil yang didapat praklikum ini adalah Reaksi warna Alkaloid - Filtrat 1 A (ekstrak piperin + perekasi dragendorf) B ( Sari 1 ditambah perekasi dragendorf) Coklat bening (-) - Filtat 2 A(ekstrak piperin + perekasi Meyer) B (Sari 1 + perekasi Meyer) Coklat bening ++ (-) Coklat bening + (-) Coklat bening (-) Hasil

Flavonoid - Tabung 1 (Sari 1 ditambah serbuk tembaga +HCL 2N, dipanaskan + amil alkohol) - Tabung 1 (Piperin ditambah serbuk tembaga Keruh coklat (-) Bening (-)

+HCL 2N, dipanaskan + amil alkohol) Tanin dan polifenol - Tabung 1( Sari 1 dipanaskan + FeCl3) - Tabung 2 (ekstrak piperin dipanaskan + FeCl3) Kuning bening (-)

Coklat tua (-)

Saponin - Tabung 1 (ekstrak piperin + air dipanaskan + HCL 0,1 N) - Tabung 1 (Sari 1 + air dipanaskan + HCL 0,1 N) Triterpenoid dan steroid Tidak berwarna, ada busa (+) Kuning keruh (-)

Tidak dilakukan karena pereaksi Liebermann Burchard habis

- Nilai Rf pada hasil isolasi piperin adalah 0,9196 pada sinar UV 366nm. Pada hasil isolasi daun sirsak sari I dan III tidak menampilkan bercak dan sari II 0.417. Nilai HRf pada hasil isolasi piperin adalah 91,96% pada sinar UV 366 dan pada hasil isolasi flavonoid pada sari II didapatkan nilai HRf sebesar 41,7% pada sinar UV 366 nm.

DAFTAR PUSTAKA

Clark, Jim. 2007. Kromatografi Lapis Tipis. http://www.chem-is-try.org. D w . 2 0 0 4 . Pratikum Kimia Organik.Departemen kimia FPMIPA ITB. Bandung Ganjar, I. G., Abdul Rohman, 2010. Kimia Farmasi Analisis.Pustaka Pelajar: Yogyakarta Harbone, J.B. 1987. Metode Fitokimia penuntun cara modern menganalisis tumbuhan terbitan kedua. Bandung: ITB. Setiono, Lilik. 2009. Kromatografi. http://liliksetiono.co.cc Stahl, E. 1985. Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopi. Penerbit ITB. Bandung.

Jawaban soal Pertanyaan. 1. Keuntungan kromatografi lapis tipis adalah : a. Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis. b. Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluorosensi atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet. c. Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending), menurun (descending), atau dengan cara elusi 2 dimensi. d. Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak. Kerugian kromatografi lapis tipis adalah : a. Waktu yang dibutuhkan cukup lama b. Harus menggunakan pelarut yang semurni mungkin c. Kurang teliti karena kurang selektif dan sensitif

2. Rutin merupakan salah satu jenis glikosida flavonoid yang bersifat polar, sehingga dapat diekstraksi dengan pelarut polar, seperti air, methanol atau etanol. Filtrate yang didapat dari hasil penyarian didinginkan untuk mempercepat pembentukan kristal. Aglikon glikosida (kuersetin) termasuk senyawa non-polar. Pemisahan aglikon dan glikosidanya dapat dilakukan dengan hidrolisis asam, seperti menggunakan HCl. Akan didapat hasil berupa kuersetin dan glukosa dari hidrolisis rutin. Analisa dari aglikon dan glikosida ini dapat dilakukan dengan menggunakan kromatografi lapis tipis, dan

menggunakan eluen tertentu sesuai dengan kepolaran senyawa yang dianalisa.