Istilah.....

Kromatografi Lapis Tipis = Thin Layer Chromatography

Pengembangan = development = eluasi = elusi
Eluen = pelarut untuk pengembangan
Eluat = pelarut yang mengandung analit hasil pemisahan

dengan kromatografi
Kromatogram = gambar hasil pemisahan
Kromatograf = alat untuk kromatografi
Rf = retardation factor = jarak migrasi analit dari titik awal

/ jarak migrasi fase gerak setelah pengembangan

RRf = 100 x Rf

suatu teknik pemisahan campuran menjadi

komponennya berdasarkan perbedaan migrasi
masing-masing komponennya dalam fase diam
akibat pengaruh dari fase gerak

Analyze
Separate

Identify
Purify

Mixture

Components

Quantify

Stationary Phase

Separation

Mobile Phase

Mixture

Components

Components

Affinity to Stationary
Phase

Affinity to Mobile
Phase

Blue

----------------

Insoluble in Mobile Phase

Black

Red

Yellow

Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi padat-cair
Kromatografi planar
Fase diam berupa lapisan tipis pada

permukaan datar di atas pendukung yang

sesuai
Keunggulan dibanding KCKT: mudah,
sederhana, murah, cepat
Kekurangan dibanding KCKT: daya pemisahan
dan sensitivitas lebih rendah, terpengaruh
lingkungan

Komponen penting pada

analisis dengan KLT
Peralatan (chamber)
Fase Diam
Fase gerak
Aplikasi sampel
Pengembangan
Deteksi bercak

Fase Diam
Fase diam pada KLT berupa fase yang polar (fase normal)
maupun fese non polar (fase terbalik).
Fase normal
1. Silica gel
Merupakan silica yang dibebaskan dari air, bersifat sedikit
asam, fase ini lebih banyak digunakan. Untuk memperkuat
pelapisannya pada pendukung, silika gel ditambah gips
(Kalsium sulfat) sehingga dikenal dengan silica gel G.
Sebagai pendukung lapisan tipis digunakan kaca, dengan
ukuran
20 x 20 cm, 10 x
20, atau
5
x
10 cm.
Pendukung yang lain berupa lembaran aluminium, atau
plastik dengan ukuran scperti diatas, yang umumnya
dibuat oleh pabrik.

Silica gel kadang-kadang ditambah senyawa

flouresens, agar bila disinari dengan sinar UV

berflourosensi atau berpendar, sebingga
dikenal dengan silica gel GF254, yang berarti
silica gel dengan flouresen yang berpendar
pada 254 nm
2.Alumina, (aluminium oksida)
Fase diam ini bersifat sedikit basa, lebih
jarang digunakan, bila akan digunakan
diaktifkan
kembali
dengan
pemanasan.
Alumina yang digunakan sebagai fase diam
untuk KLT umumnya yang bebas air, schingga
mempunyai aktivitas penjerapan lebih tinggi.

3. Kiselguhr
Sebenarnya merupakan asam silica yang amorf,

berasal dari kerangka diatomeae, maka lebih dikenal

dengan nama tanah diatome, kurang bersifat
adsorptif dibanding silica.
4. Magnesium silicat
Nama lain dalam perdagangan dikenal dengan
floresil, hanya digunakan bila adsor ben atau
penjerab lain tidak dapat digunakan.

5 Selulose
Polaritasnya tinggi dapat digunakan sebagai pemisah
sccara partisi, baik dengan bentuk kertas maupun
bentuk Icmpeng. Keduanya masih sering dipakai
misalnya untuk pemi sahan flavanoid.

Fase diam
Umumnya digunakan silika
Dapat ditambahkan pengikat dan indikator

fluoresensi
Mekanisme dominan: adsorbsi kadang partisi
Fase gerak/eluen/pelarut
Berdasarkan polaritas
Biasanya campuran
Studi pustaka dan coba-coba

Prinsip: like dissolves like

Senyawa polar lebih tertahan oleh fase diam
Senyawapolar lebih mudah larut dalm fase gerak

yang polar

Simbol-simbol Pelat KLT

Si atau Sil Mengandung silika
60 Ukuran pori
F atau UV Mengandung indikator fluoresensi
254 atau 366
Setelah simbol F atau UV untuk

menunjukkan
panjang gelombang eksitasi indikator
fluoresensi
G
Pengikat gipsum (kalsium sulfat)
H atau N Tanpa pengikat
RP Reversed Phase, silika yang dimodifikasi dengan
hidrokarbon
2, 8, 18
Panjang rantai karbon yang diikatkan pada silika
P
Untuk preparativ

Kekuatan elusi pelarut pada silika dan polaritas

pelarut

FASE GERAK
1. Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang

sangat tinggi karena KLT merupakan teknik yang sensitif.

2. Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa
sehingga harga Rf terletak antara 0,2-0,8 untuk
memaksimalkan pemisahan.
3. Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam
polar seperti silika gel, polaritas fase gerak akan
menentukan kecepatan migrasi solut yang berarti juga
menentukan nilai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat
sedikit polar seperti dietil eter ke dalam pelarut non polar
seperti metil benzene akan meningkatkan harga Rf
secara signifikan (Gandjar & Rohman, 2007)

Bagaimana mendapatkan komposisi fase

gerak yang baik untuk KLT????
1. Cari di pustaka (jika ada)
2. Jika tidak ada, cari yang sifatnya mirip
3. Jika tidak ada yang mirip lakukan percobaan
a. Lakukan eluasi dengan fase gerak paling non
polar
b. Lakukan kenaikan kepolaran secara gradien
c. Evaluasi hasil, dan tentukan komposisi yang
paling baik

TABEL. Beberapa Sistem Pemisahan dengan KLT dari Bahan Alam (Gibbons, 200
Eluen
Heksan : Etil asetat
Petrol : Dietileter

Fase Diam
Silika Gel
Silika Gel

Petrol : Kloroform

Silika Gel

Toluen : Etil asetat : Silika Gel

Asam asetat (TEA)
Kloroform : Aseton Silika Gel
n-Butanol : Asam Silika Gel
Asetat : Air
Metanol : Air
C18
Asetonitril : Air
Metanol : Air

C18
Selulosa

Keterangan
Sistem umum yang digunakan
Sistem umum yang digunakan untuk senyawa
nonpolar seperti terpen dan asam lemak
Berguna untuk pemisahan derivat asam sinamat
dan kumarin
Komposisi 80:18:2 v/v atau 60:38:2 v/v baik
untuk pemisahan metabolit asam
Sistem umum untuk produk dengan polaritas
sedang
Sistem polar untuk flavonoid dan glikosida
Dimulai dengan metanol 100% dilanjutkan
dengan penambahan konsentrasi air
Sistem umum Reverse phase
Memisahkan senyawa dengan kepolaran tinggi
seperti gula dan glikosida

Contoh Peningkatan Kepolaran secara

Gradien

Metanol:etil-asetat: (1:10)
Metanol:etil-asetat: (2:10)
Metanol:etil-asetat: (3:10)
Metanol:etil-asetat: (4:10)
Metanol:etil-asetat: (5:10)
Dst.

Tingkatkan kepolaran
Rf sebaiknya 0,5

Turunkan kepolaran
Rf sebaiknya 0,5

MENETESKAN
SAMPEL

Gunakan luas plat sesuai kebutuhan

Buat garis dg jarak 8 10 mm (u/ plat mikro) dan

1,5 2,0 cm (u/ plat makro) dari dasar plat.

Sampel dilarutkan dalam zat pelarut yang mudah
menguap (ttk didihnya 50 100oC)
Larutan sampel diteteskan pada plat menggunakan
pipet mikro atau syringe dan dibiarkan mengering
sebelum tetesan berikutnya dikerjakan.
Jumlah sampel yang diteteskan dpt berkisar antara
5-100g dari larutan 0,1 %
Pengeringan tetesan sampel menggunakan gas N2

untuk mencegah terjadinya kerusakan sampel

karena oksidasi.

PENGEMBANGAN
Menggunakan wadah tertutup yg berisi

senyawa pelarut.
Mencelupkan dasar plat yg telah ditetesi
sampel dalam sistem pelarut.
Pemilihan sistem pelarut atas dasar like
dissolves like, misalnya untuk memisahkan
lipida digunakan sistem pelarut heksan :
eter : asam asetat = 80 : 20 : 1
Pengembangan di akhiri bila ujung zat
pelarut pada plat telah mencapai +
tinggi adsorben (15 16 cm)
Pengeringan plat dg aliran gas N2

METODE
PENGEMBANGAN
Pengembangan satu dimensi

Berjalan 1 arah dg 1 macam sistem pelarut

Pengembangan dua dimensi

Dikerjakan 2 arah
Sampel di teteskan di pojok kanan bawah ( 2
cm dari kanan & bawah) untuk plat 20 x 20
cm
Setelah pengembangan I selesai, plat
dikeringkan dg gas N2

Setelah kering, plat dikembangkan lagi dg

menggunakan sistem pelarut yang ke II dg

memeutar plat 90o.

Pengembangan ganda
Dikerjakan searah (1 dimensi) dan
dilaksanakan beberapa tahap (umumnya 2
tahap)
Sistem pelarut yg digunakan berbeda
Masing-masing tahap pengembangan di akhiri
dg pengeringan sblm dilakukan pengembangan
berikutnya.
Mis. Pemisahan lipida netral dan lipida polar .
Pengembang I = kloroform : metanol : aquades
= 60 : 25 : 4, dihentikan setelah permukaan
pelarut mencapai 10 cm. Setelah pengeringan,
dikembangkan lagi dg sistem pelarut Heksan :
Eter = 4 : 1.

Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen

jarak yang ditempuh oleh pelarut

Hal-hal yang harus diperhatikan

dalam KLT :
a. Lempeng yang akan digunakan harus diaktifkan terlebih

dahulu agar pada proses elusi lempeng silica gel dapat

menyerap dan berikatan dengan sampel. Pengaktifan lempeng
dilakukan dalam oven pada suhu 110 0C selama 30 menit.
b. Chamber harus dijenuhkan untuk menghilangkan uap air
atau gas lain yang mengisi fase penjerap yang akan
menghalangi laju eluen.
c. Pada saat penotolan, hendaknya sampel jangan terlalu
pekat sebab pemisahannya akan sulit sehingga didapat noda
berekor.
d. Penotolan harus tepat sehingga didapatkan jumlah noda
yang baik.
e. Eluen yang digunakan harus murni sehingga tidak
menghasilkan noda lain.

Deteksi Bercak
Berwarna atau tidak
Dengan lampu UV 254/366 nm
Jika menggunakan pelat KLT F: bercak yang

tidak berfluoresensi terlihat sebagai

pemadaman (gelap) pada latar belakang
hijau/biru
Dengan penampak bercak
Disemprot/dicelup/diuapi
Destruktif/tidak
Umum/selektif

VISUALISASI DAN
IDENTIFIKASI
Untuk melihat komponen penyusun yg

sudah terpisah setelah proses

pengembangan
Bersifat destruktif dan non destruktif

o destruktif akan merusak sampel secara irreversible

(u/ pengukuran kuanti & kualitatif)

o nondestruktif baik u/KLT preparatif & pengukuran
kuantitatif

Bersifat umum dan spesifik

Identifikasi
o membandingkan posisi spot dg senyawa standar
o visualisasi khusus (mis. Dg ninhidrin, senyawa yg

mengandung gugus amino akan menunjukkan spot

kuning jingga)

Uap iodium
Spot akan berwarna coklat dg dasar putih
Tidak merusak komponen yg telah terpisah
Dpt digunakan u/semua senyawa organik yg

tidak jenuh (dg ikatan rangkap)

Sinar UV
memberikan fluoresensi pd plat yg
mengandung unsur fosfor
sifatnya non destruktif

Charring
penyemprotan plat dg lar H2SO4/K2Cr2O7 kmdn

dipanaskan pd suhu 125oC

Zat organik akan mengalami oksidasi menjadi
karbon yang berwarna hitam

Reagensia umum
(terbatas u/ senyawa organik yg non volatil)
H2SO4 pekat
senyawa organik akan mjd spot hitam

H2SO4 - Na2Cr2O7
senyawa organik akan mjd spot hitam

H2SO4 - K2Cr2O7
senyawa organik akan mjd spot hitam

H2SO4 HNO3
senyawa organik akan mjd spot hitam

HClO4
senyawa organik akan mjd spot hitam

Iodium
senyawa organik akan mjd spot coklat

Reagen Spesifik
Untuk mendeteksi secara kualitatif &

mengenal adanya gugus tertentu dalam

senyawa yg dipisahkan.
Reagensia ini bersifat destruktif

 Anilin pthalat
Spot yg terdiri dari gula-gula reduksi akan

memberikan berbagai warna

Anisaldehid dlm H2SO4 dan HOAc
Senyawa ini untuk menunjukkan adanya
karbohidrat.
Karbohidrat menunjukkan warna biru
Antimon triklorida dalam CHCl3
Senyawa ini mendeteksi adanya senyawa steroid,
steroid glikosida,lipida alifatik,dan vit A.
Zat tsb dg UV akan menunjukkan berbagai warna
tertentu
Bromokresol jambon
Untuk pengenalan ion-ion halogen kec. F & asam
dikarboksilat
Senyawa tsb akan menunjukkan warna kunin atau
jingga

 Bromokresol hijau
Pengenal asam karboksilat
Senyawa tersebut akan memberikan warna

kuning/jingga

2,4 Dinitrofenilhidrazin (2,4 DPNH)

Pengenal aldehid dan keton yg akan

membentuk warna kuning sampai kemerahan.

Reagensia Dragendorf
Pengenal berbagai alkaloid dan basa organik

(mberikan warna orange)

Feri Klorida
Senyawa fenol & menunjukkan berbagai warna.

Fluorescein-Br2
Pengenal senyawa organik tidak jenuh ( Dg

UV akan menunjukkan warna tertentu)

8-Hidroksiquinolin-NH3
Pengenal kation anorganik (dg UV akan

terlihat berbagai warna)

Ninhidrin
Gugus amino akan berwarna biru.

Tabel Beberapa penggunaan pelacak bercak pada

kromatografi kertas
Nama
pereaksi
l.Sinar UV254 nm

Analit

Senyawa flouresen
Seny.Amin
2 lodoplatinat
ter/kuaterner
3.Pereaksi
furfural Turunan Karbamat

Nama
pereaksi

Analit

9. Pereaksi
Marquis

Tur. morfin

Fenol, aril
10. Peraksi Millon amin Ikatan
11 .KMn04 +
tak jenuh
as.sulfet
Sebyawa
fiuoresen
Amin
ter/kuater.
4.Pereaksi Simon Heterosiklik amin
12 .NinhidrinTurunan
As. amino
Nitroso-naftol primer
karbamat HeterosikUk amin13.
kanabinol,
Ergot
sulfonamida
Alkaloid/Amin
kuar
Ter.Heksa(penta
Karbinol/Sulfonamid 14. Pereaksi
5.DABdlm etanol
alkaloid
klorfenol) Ikatan
rangkap, seny.organik
Mandelin
Turunan
a

6.Dragendorff
ajmalin
Alkaloid/amin kuater,
15. Vanilinas.
Barbiturat
Ter.Heksa/penta
Sulfat
fenetoin,
klorfenol
7. Uap iodium
8. UapNO2
S
Ikatan rangkap/
senyawa organik
36
36

37

38

Profil KLT fraksi aktif

ekstrak daun pecut kuda (S. jamaicensis)

Fase gerak : CHCl3 : MeOH : EtOAc (9:3:5) ;

Fase diam = Silika Gel F254;
H fraksi heksan, C fraksi kloroform, E fraksi etil

Reagen fosfomolibdat u/ deteksi senyawa

terpenoid dan warna yg dihasilkan adlh hijau

kebiruan.
Reagen H2SO4 u/ deteksi senyawa terpenoid

yg akn mnghslkn warna spot coklat, hijau,

kuning, merah atau biru. Pd perlakuan H2SO4
50% kmdn dipanaskan suhu 100-110oC
selama 5 mnt,mnghslkn spot coklat

JENIS KLT
A. KLT Preparatif

Tebal adsorben 1 1,5 mm (makin tebal,

pemisahannya makin sulit)

Pengeringan adsorben harus optimal

u/mencegah case hardening dan retak.

2 ml sampel (50-250 mg) diaplikasikan dg cara

menggariskan setebal 5-8 mm pada garis dasar
(tidak smp merusak adsorben)

Cara visualisasi yg dipakai dg non destruktif,

terutama dg UV, penyemprotan dg air atau uap
iodium.

Komponen terpisah dikerok, diletakkan dlm

corong dg kertas filter

Diekstrak dg pelarut yang polaritasnya sesuai.

B. KLT Kuantitatif, dilakukan pendekatan dg :

Analisa langsung pada plat, dengan :

Charring secara standar, kmd digunakan
densitometer untuk menentukan
kuantitasnya
Pengukuran radioaktivitasnya, khususnya
senyawa yg ditandai dg radioaktif
Dengan neutron activation analysis

Gravimetri : masing2 komponen diisolasi,

diekstrak, diuapkan dan ditimbang.

Menganalisis elemen-elemen spesifik atau

gugus fungsional dengan spektrofotometer.

C. KLT dengan argentasi

U/ pemisahan senyawa yang mempunyai jumlah

ikatan rangkap yang berbeda & isomer cis dan trans
dr asam lemak.

Plat adsorben mengandung AgNO3 :

Mencelup plat KLT ke dalam larutan AgNO3 1012%,atau
Menambahkan larutan AgNO3 dlm pembuatan
larutan adsorben

Sistem pelarut campuran heksan eter dg proporsi yg

bervariasi tergantung jumlah ketidak jenuhan
senyawanya
u/ memisahkan monoenoat (ik. Rangkap 1) = 93 : 7
u/ dienoat (ik. Rangkap 2) = 83 : 17
u/ monoena, diena, triena, tetraena, pentaena,
heksaena dari metil esternya = 60 : 40.