Kromatografi Lapis Tipis

(KLT)
KLT/TLC

 Thin Layer Chromatography (TLC)

 Izmailoff dan Schraiber, 1938
 Termasuk kromatografi planar
 Fase diam berupa lapisan yg seragam (uniform)
pada permukaan bidang datar yang didukung
oleh lempeng kaca, pelat aluminium, atau pelat
plastik
 Fase gerak sebagai pelarut pengembang akan
bergerak sepanjang fase diam (ascending,
descending)
Keunggulan
 Lebih mudah dan lebih murah dari kromatografi kolom
 Peralatan lebih sederhana
 Banyak digunakan utk tujuan analisis
 Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dg
pereaksi warna, fluoresensi atau dg radiasi sinar uv
 Dapat dilakukan elusi secara mearik (ascending),
menurun (descending) atau elusi 2 dimensi
 Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena
komponen yg akan ditentukan merupakan bercak tidak
bergerak
Ilustrasi kerja KLT
Fase Diam KLT

 Merupakan pejerap dg diameter partikel 10-30μm

 Makin kecil uk rata2 partikel fase diam, makin baik efisiensi
dan resolusi
 Paling sering digunakan : silika dan serbuk selulosa,
 dapat juga dari silika yg dimodifikasi, resin penukar ion, gel
eksklusi dan siklodekstrin
 Mekanisme sorpsi utama: partisi dan adsorpsi
 Lempeng KLT disiapkan dg melapiskan penjerap ke
permukaan lap kaca, gelas, atau aluminium dg ketebalan
250μm dan ditambah agen pengikat (ex. Ca-sulfat)
Beberapa penyerap yg digunakan pada KLT
Tatanama lempeng KLT
Modifikasi fase diam / penjerap

 Perlakuan silika dg KOH

 Fase diam silika disemprot dg lar KOH dalam metanol
 Utk analisis senyawa2 basa
 Didapat kromatogram senyawa dalam bentuk basa bebas
 KOH menekan interaksi kuat senyawa basa dg gugus silanol
pada fase diam
 fase gerak yg digunakan juga mengandung komponen yg
bersifat basa (ex: metanol/amonia (100:1,5);
sikloheksana/toluena/dietilamina (75:10:15); kloroform/metanol
(90:10))
 Pembaceman silikia gel
 Permukaan silika gel dibuat non polar dg cara pembaceman mengunakan
diklorodimetilsilana
 Pembaceman dg oktadesilsilana (ODS) menghasilkan lempeng silika gel ODS
 Pembaceman dapat juga dg parafin cair, minyak silikon atau dg lemak 
identifikasi hormon steroid

Gbr pembaceman silika gel dg diklorodimetilsilan

Bahan-bahan pembaceman silika
 Keiselguhr sebagai pendukung lembam (inert)
Mempunyai sifat absorptif yg kuat
Keiselguhr dapat dilapiskan pada fase diam berlilin
(dg cairan parafin)  uji trigliserida dan asam lemak
dalam minyak
Lempeng keiselguhr dibacem g larutan yg
mengandung cairan parafin dalam petroleum eter
Fase gerak KLT

 Sistem paling sederhana : campuran 2 pelarut organik  daya elusi

mudah diatur  pemisahan optimal
 Optimasi fase gerak :
 Fase gerak harus mempunyai kemurnian yg sgt tinggi
 Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga
harga Rf terletak antara 0,2-0,8
 Pemisahan dg fase diam polar akan menentukan kecepatan
migrasi solut  menentukan nilai Rf > penmabhan pelarut yg
bersifat sedikit polar ke dalam pelarut nonpolarmneingkatkan
harga Rf
 Solut-solut ionik dan solut-solut polar lebih baik digunakan
campuran pelarut sbg fase geraknya, misal air/metanol
Penotolan Sampel

 Pemisahan optimal  penotolan sampel dg ukuran bercak sekecil

dan sesempit mungkin
 Penotolan secara otomatis lebih dipilih daripada penotolan secara
manual jika sampel yg dititolkan lebih dari 15μl
 Jika sampel terlalu besar  menurunkan resolusi
 Penotolan sampel yg tidak tepat  bercak menyebar dan puncak
ganda
 Volume sampel yg akan ditotolkan paling sedikit 0,5 μl  reprodusibiltas
 Jika yang akan ditotolkan lebih besar dari 2-10μl penotolan harus secara
bertahap dg dilakukan pengeringan antar totolan

Parameter-parameter aplikasi yg direkomendasikan

Pengembangan

 Sampel yg telah ditotolkan ikembangkan dalam bejana kromatografi yg

sebelumnya telah dijenuhi dg uap fase gerak
 Tepi bagian bawah lempeng tipis dicelupkan ke dalam fase gerak kurang
lebih 0,5-1cm
 Timggi fase gerak harus dibawah lempeng yg berisi totolan sampel

Gbr elusi KLT

Deteksi bercak

 Umumnya bercak pemisahan tidak berwarna

Cara kimia  penyemprotan reagen kimia
Cara fisika  pencacahan radioaktif dan fluorosensi
sinar uv
Cara biologi
 Menyemprot lempeng KLT dg reagen kromogenik  bercak menjadi
berwarna
 Mengamati bercak dibawah lampu UV yg dipasang pada pjg gelombang
emisi 254 atau 366  bercak gelap atau bercak berfluorosensi terang
 Menyemprot lempeng dg asam sulfat pekat atau asam nitrat pekat 
dipanaskan (oksidasi solut)  bercak hitam atau kecoklatan
 Memaparkan lempeng dg uap iodium dlm chamber tertutup
 Scanning pd permukaan lempeng dg densitometer  mengukur intensitas
radiasi yg direfleksikan dr permukaan lempeng
 Reagen umum dan selektif
Alternatif prosedur KLT

 KLT 2 arah / 2 dimensi

Meningkatkan resolusi sampel ketika komponen2 solut
memiliki karakteristik kima yg hampir sama
 Pengembangan kontinyu
Mengalirkan fase gerak secara terus menerus pada
lempeng KLT
 Pengembangan gradien
Menggunkana komposisi fase gerak yg berbeda-
beda
Penggunaan KLT

 Analisis kualitatif
Uji identifikasi senyawa baku
Parameter : RF  dua senyawa dikatakan identik jika
mmepunyai nilai Rf yg sama
 Analisis kuantitatif
Pengukuran luas bercak pada lempeng dg
menggunkana ukuran luas atau dg teknik
densitometri
Mengerok bercak lalu menetapkan kadar senyawa
yg terdapat dalam bercak tsb dg metode
spektrofotometri
 Analisis preparatif
Ditujukan utk memisahkan analit dalam jumlah
banyak lalu senyawa yg dipisahkan dianalisis lebih
lanjut
Sampel ditotolkan dalam lapisan lempeng yg besar
lalu dikembangkan dan dideteksi dg cara yg non-
destruktif  bercak dikerik dan dianalisis lebih lanjut