 Prinsip sama dengan kromatografi lapis tipis

 Dilaksanakan dalam suatu kolom yg diisi dg

fase stasioner yg porous
 Digunakan cairan sbg fase mobil u/mengelusi
komponen sampel keluar dari kolom
 Kolom digunakan untuk memurnikan
senyawa / pemisahan campuran
 Dapat diterapkan pada skala besar
1. Eluent, berfungsi sebagai fase gerak yang
akan membawa sampel masuk ke dalam
kolom pemisah.
2. Pompa, berfungsi untuk mendorong eluent
dan sampel masuk ke dalam kolom.
Kecepatan alir ini dapat dikontrol dan
perbedaan kecepatan bisa mengakibatkan
perbedaan hasil.
3. Injektor, tempat memasukkan sampel dan
selanjutnya sampel dapat didistribusikan
masuk ke dalam kolom.
4. Kolom pemisah, berfungsi untuk
memisahkan ion-ion yang ada dalam
sampel. Keterpaduan antara kolom dan
eluent bisa memberikan hasil/puncak yang
maksimal, begitu pun sebaliknya, jika tidak
ada "kecocokan", maka tidak akan
memunculkan puncak.
5. Detektor, berfungsi membaca ion yang
lewat ke dalam detektor.
6. Rekorder data, berfungsi merekam dan
mengolah data yang masuk
 Kelebihan Kromatografi Kolom :
1. Dapat digunakan untuk analisis dan aplikasi preparatif
2. Digunakan untuk menentukan jumlah komponen
campuran karena komponen- komponen penyusunnya
akan terpisahkan pada saat elusi berlangsung.
3. Dapat digunakan untuk analisis dan aplikasi preparative
4. Digunakan untuk menentukan jumlah komponen
campuran
5. Digunakan untuk memisahkan dan purifikasi substansi
 Kekurangan Kromatografi Kolom :
1. Untuk mempersiapkan kolom dibutuhkan
kemampuan teknik dan manual.
2. Membutuhkan waktu yang lama
JENIS KROMATOGRAFI KOLOM
 Kromatografi Adsorbsi, komponen yg dipisahkan scr
selektif teradsorbsi pd permukaan adsorben yg dipakai
u/bhn isian kolom.
 Kromatografi Partisi, komponen mngalami partisi
antara lapisan cairan tipis pd penyangga padat yg
bertindak sbg fase stasioner & eluen yg bertindak sbg
fase gerak (mobil).
 Kromatografi Pertukaran Ion, memisahkan komponen
yg berbentuk ion yg terikat pd penukar ion sbg fase
stasioner scr selektif akan terlepas/terelusioleh fase
mobil.
 Kromatografi Filtrasi Gel, kolom diisi dg gel yg
permeabel sbg fase stasioner, dan pemisahan
berlangsung spt proses pengayakan yg didasarkan pd
ukuran molekul dr komponen yg dipisahkan.
KROMATOGRAFI ADSORBSI

 Zat padat sbg adsorben / fase stasioner

 Alumina & silika gel paling populer
 Urutan dr kemampuan adsorbsi bsr ke kcl :
 Alumina
 Charcoal
 Silika gel
 Magnesium
 Kalium karbonat
 Sukrosa
 Starch
 Selulosa
 Zat cair sbg fase mobil
 Zat pelarut yg mampu mlakukn elusi terlalu cepat tdk
mampu memisahkan dg baik
 Elusi yg terlalu lambat mnyebabkan waktu retensi yg trlalu
lama
 Golongan pelarut yg diurutkan dg dasar kenaikan
adsorbilitasnya pd kolom alumina :
 Perfluorokarbon
 Hidrokarbon jenuh
 Hidrokarbon tak jenuh
 Halida & eter
 Aldehid & keton
 Alkohol & thiol
 Asam & basa
 Kolom kromatografi bekerja berdasarkan skala yang
lebih besar menggunakan material terpadatkan
pada sebuah kolom gelas vertikal.
PENGISIAN & CARA KERJA KOLOM

 Pemasukan absorben kedlm kolom.

 Kepadatan diseragamkan dg
vibrator/plunger/ dlm bntuk larutan (slurry) &
partikelnya dibiarkan mngendap.
 Fungsi glass wool di atas & dasar kolom sbg
penyangga isian.
 Kecepatan elusi dibuat konstan 1 cm/mnt
 Penggunaan kolom

 u/memisahkan campuran dari dua

senyawa dg membuat larutan jenuh dari
campuran menggunakan pelarut yang
lebih disukai dalam kolom.

 Membuka kran penutup untuk

membiarkan pelarut yang sudah berada
dalam kolom mengering sehingga
material terpadatkan rata pada bagian
atas
 Menambahkan larutan secara hati-hati
dari bagian atas kolom. Kmdn kran
dibuka kembali sehingga senyawa
campuran akan diserap pada bagian
atas material terpadatkan, sehingga
akan tampak seperti gambar brkt ini:
 Selanjutnya ditambahkan
pelarut baru melalui
bagian atas kolom &
cegah sedapat mungkin
jangan sampai merusak
material terpadatkan
dalam kolom.
 Kmdn kran dibuka,
supaya pelarut dapat
mengalir melalui kolom
 Pelarut dikumpulkan
dalam satu gelas kimia
atau labu dibawah kolom.
 Pelarut mengalir kontinyu,
shg tetap ditambahkan
pelarut baru dari bagian
atas kolom sehingga
kolom tidak pernah kering.
 Fase stasioner berupa cairan, fase mobil dpt brp :
 Cairan (HPLC = High Performance Liquid
Chromatography)
 Gas (GLC = Gas Liquid Chromatography)

 Kelebihan HPLC :
 Daya ulangnya lebih baik.
 Dari data kelarutan,hslnya dapt diprediksikan
 Dpt menghasilkan puncak yg simetris dan lebih tajam
 u/senyawa yg stabilitas thd suhu terbatas
 Mrpkn teknik analisis yg peka & dpt memisahkan senyawa
yg sangat serupa dg resolusi yang baik.
 Waktu pemisahan singkat 5-10 mnt
 U/analisa kuantitatif
FASE STASIONER
 Ada 2 tipe bhn isian yaitu :
 Pellicular beads
o Bgn dlm padat tdk berpori
o Dr silika
 Microporous particle
 Ukurannya kcl 3-10mm shg luas prmukaan besar
 Effisiensi tinggi krn jmlh plat teoritik 10.000 dlm kolom 25
cm.
 Pelarut lebih polar sbg fase stasioner (=
kromatografi fase normal)
 Pelarut non polar (krom fase terbalik)
HPLC FASE NORMAL (Kolom dan pelarut)

a. Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil

dan pelarut non polar misalnya heksan. Sebuah
kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6
mm (dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan
panjang 150 sampai 250 mm.

b. Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui

kolom akan melekat lebih lama pada silika yang
polar dibanding degan senyawa-senyawa non
polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar
kemudian akan lebih cepat melewati kolom.
 Fase balik HPLC

a. ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi

menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai
hidrokarbon panjang pada permukaannya secara
sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18.

b. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa

campuran air dan alkohol seperti metanol.
KOLOM
 Panjang 10-25 cm dan diameter 4,5-5,0 mm
yg diisi dg fase stationer berukuran rata-rata
5-10mdr bahan stainless steel
DETEKTOR
 Mempunyai sensitivitas yg tinggi
 Bersifat linear u/jangka konsentrasi tertentu
 Dapat mendeteksi eluent tanpa
mempengaruhi resolusi kromatogam
 Tdk terlalu peka terhadap perubahan
berbagai parameter terutama suhu & tekanan
MACAM DETEKTOR
 Detektor UV
 Sebagian senyawa punya serapan khusus di daerah
UV & sinar tampak
 Pengukuran scr kuantitatif berdasar hk Lambert-Beer yg
mngubkan besaran absorbansi dg konsentrasi solute.
 Hrs digunakan sinar monoromatik/dg panj.gel sempit (2-4
nm)
 Tipe detektor dg daerah deteksi UV (200-400nm) dan sinar
tampak (400-700 nm) tlh ada shg dpt mndeteksi hmpr
semua senyawa organik.
 Detektor Fluoresensi
 u/senyawa yg fluoresen
 Bersft spesifik dan lbh selektif
 Sgt peka & dpt mndeteksi kdar senyawa yg sgt kcl spt
aflatoksin, seny aromatik berinti byk, vitamin ttt & derivat
asam amino
 Kelemahannya krn kepekaan thd senyawa asing sbg
kontaminan dlm eluen yg dpt mngganggu kuantifikasi
 Detektor Konduktivitas
 Prinsip kerja mngukur konduktivitas eluen dari kolom
 u/mngukur senyawa yg bersft ionik
 Perlu dihindari pnggunaan buffer ion krn mpnyai
konduktivitas yg tinggi
 Detektor Indeks Refraksi
 Prinsip krja perubahan nilai indeks refraksi dr suatu cairan
yg mngalir
 u/ analisis gula dan lemak
 Detektor FID (Flame Ionization Detector)
 Senyawa pelarut dihilangkan dahulu
 Dianalisa senyawa yg target
 Eluen dr kolom dialirkan pd permukaan kawat ke
evaporator kmdn ke alat pirolisis dan ke FID
Diagram alir HPLC
Waktu retensi
 Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk
bergerak melalui kolom menuju detektor.
 Waktu retensi diukur berdasarkan waktu
dimana sampel diinjeksikan sampai sampel
menunjukkan ketinggian puncak yang
maksimum dari senyawa itu.
 Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki
waktu retensi yang berbeda.
Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan
sangat bervariasi dan bergantung pada:

 tekanan yang digunakan (karena itu akan

berpengaruh pada laju alir dari pelarut)
 kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat
dari material apa, tetapi juga pada ukuran
partikel)
 komposisi yang tepat dari pelarut
 temperatur pada kolom