KROMATOGRAFI

Asal : Yunani
Penulisan dengan warna sudah tidak tepat
lagi, karena dapat juga dipisahkan senyawa yang
tidak berwarna.

Michael Tsweett (1906) Pemisahan klorofil dari

pigmen-pigmen lain pada ekstrak tanaman
menggunakan peralatan berupa kolom gelas yang
diisi bubuk kalsium karbonat.
Kalsium karbonat sebagai adsorben
Larutan eter yang mengandung ekstrak pigmen (sampel)
dituangkan pada bagian atas kolom
Kolom dicuci dengan cara menambahkan lagi eter dan dibiarkan
mengalir ke bawah setelah beberapa saat: pigmen yang semula
satu warna menjadi beberapa warna yang berurutan dari bagian
atas sampai bawah (tampak sebagai zone-zone berwarna)
Pigmen yang lebih kuat terserap oleh adsorben menggantikan
tempat yang ditempati oleh pigmen yang terserap lebih lemah dan
memaksa pigmen yang lebih lemah turun lebih ke bawah
 KROMATOGRAFI KOLOM
Column Chromatography
Including preparative liquid chromatography
Kolom : looks like a burette, made of glass, polymer, metal
Ukuran bervariasi diameter dan panjang. Minimal panjang
kolom 10 kali diameternya.
Fase diam :
Perbandingan berat (fase diam : sampel = 30 : 1 dapat
ditingkatkan 50 : 1 untuk sampel yg sukar dipisahkan)
ukuran partikel 63-250 mm, yg <63mm fase gerak perlu
ditekan atau dihisap
Biasa digunakan : silika gel, alumina
Fase gerak : eluen / solven
Pemilihan fase gerak : - Penelusuran pustaka
- Mencoba-coba dengan KLT
Mengemas kolom (packing )
- Cara basah
- Cara kering
- Cara Bubur
Preparasi sampel (penyiapan sampel)
-Sampel dilarutkan,kemudian dituang pada bagian atas
kolom.
-Sampel dilarutkan, kemudian dihomogenkan dg fase
diam (1:3) dikeringkan. Diratakan selapis diatas fase
diam.
Mendeteksi eluat (efluen)
- detektor
- KLT
 Prinsip sama dengan kromatografi lapis tipis
Dilaksanakan dalam suatu kolom yg diisi dg
fase stasioner yg porous
Digunakan cairan sebagai fase mobil untuk
mengelusi komponen sampel keluar dari
kolom
Kolom digunakan untuk memurnikan
senyawa / pemisahan campuran
Prinsip pemisahan :
Sampel yang merupakan campuran bermacam
komponen dialirkan melewati sistem kromatografi
komponen akan bergerak dengan kecepatan
yang berbeda terjadi pemisahan.
1. Eluent, berfungsi sebagai fase gerak yang
akan membawa sampel masuk ke dalam
kolom pemisah.
2. Pompa, berfungsi untuk mendorong eluent
dan sampel masuk ke dalam kolom.
Kecepatan alir ini dapat dikontrol dan
perbedaan kecepatan bisa mengakibatkan
perbedaan hasil.
3. Injektor, tempat memasukkan sampel dan
selanjutnya sampel dapat didistribusikan
masuk ke dalam kolom.
4. Kolom pemisah, berfungsi untuk
memisahkan ion-ion yang ada dalam
sampel. Keterpaduan antara kolom dan
eluent bisa memberikan hasil/puncak yang
maksimal, begitu pun sebaliknya, jika tidak
ada "kecocokan", maka tidak akan
memunculkan puncak.
5. Detektor, berfungsi membaca ion yang
lewat ke dalam detektor.
6. Rekorder data, berfungsi merekam dan
mengolah data yang masuk
Diagram kromatografi kolom konvensional
JENIS KROMATOGRAFI KOLOM
Kromatografi Adsorbsi, komponen yg dipisahkan scr
selektif teradsorbsi pd permukaan adsorben yg
dipakai u/bhn isian kolom.
Kromatografi Partisi, komponen mngalami partisi
antara lapisan cairan tipis pd penyangga padat yg
bertindak sbg fase stasioner & eluen yg bertindak sbg
fase gerak (mobil).
Kromatografi Pertukaran Ion, memisahkan komponen
yg berbentuk ion yg terikat pd penukar ion sbg fase
stasioner scr selektif akan terlepas/terelusi oleh fase
mobil.
Kromatografi Filtrasi Gel, kolom diisi dg gel yg
permeabel sbg fase stasioner, dan pemisahan
berlangsung spt proses pengayakan yg didasarkan pd
ukuran molekul dr komponen yg dipisahkan.
FASE DIAM
Zat padat sbg adsorben / fase stasioner
Alumina & silika gel paling populer
Urutan dari kemampuan adsorbsi besar ke kecil
(dari paling polar ke paling nonpolar) :
Alumina
Charcoal
Silika gel
Magnesium
Kalsium karbonat
Sukrosa
Starch
Selulosa
Resin-resin polimerik (stiren/difenil benzena)
FASE GERAK/FASE MOBIL
Zat cair sbg fase mobil
Zat pelarut yg mampu melakukan elusi terlalu cepat tidak
mampu memisahkan dengan baik
Elusi yang terlalu lambat mnyebabkan waktu retensi yg
terlalu lama
Golongan pelarut yg diurutkan dengan dasar kenaikan
adsorbilitasnya (kemampuan terserap) pada kolom
alumina :
Perfluoro karbon
Hidrokarbon jenuh
Hidrokarbon tak jenuh
Halida & eter
Aldehid & keton
Alkohol & thiol
Asam & basa
Daftar urutan pelarut berdasarkan kepolaran
 Separation by
Chromatography

sample
mixture

a chromatographic column

stationary phase mobile phase detector

selectively absorbs sweeps sample
components down column

http://antoine.frostburg.edu/chem/senese/101/matter/slides/sld006.htm
 Separation by
Chromatography

sample
mixture

a chromatographic column

stationary phase mobile phase detector

selectively absorbs sweeps sample
components down column

http://antoine.frostburg.edu/chem/senese/101/matter/slides/sld006.htm
Campuran A dan B dipisahkan oleh pergerakan
fasa gerak ketika sebagian molekul teradsorbsi
pada fasa diam
PENGISIAN & CARA KERJA KOLOM

Pemasukan absorben kedlm kolom.

Kepadatan diseragamkan dg
vibrator/plunger/ dalam bentuk larutan (slurry)
& partikelnya dibiarkan mengendap.
Fungsi glass wool di atas & dasar kolom sbg
penyangga isian.
Kecepatan elusi dibuat konstan 1 mL/mnt
 Penggunaan kolom

u/memisahkan campuran dari dua/lebih

senyawa dg membuat larutan jenuh dari
campuran menggunakan pelarut yang
lebih disukai dalam kolom.

Membuka kran penutup untuk

membiarkan pelarut yang sudah berada
dalam kolom mengering sehingga
material terpadatkan rata pada bagian
atas
Menambahkan larutan secara hati-hati
dari bagian atas kolom. Kmdn kran
dibuka kembali sehingga senyawa
campuran akan diserap pada bagian
atas material terpadatkan, sehingga
akan tampak seperti gambar brkt ini:
 Selanjutnya ditambahkan
pelarut baru melalui
bagian atas kolom &
cegah sedapat mungkin
jangan sampai merusak
material terpadatkan
dalam kolom.
Kmdn kran dibuka,
supaya pelarut dapat
mengalir melalui kolom
Pelarut dikumpulkan
dalam satu gelas kimia
atau labu dibawah kolom.
Pelarut mengalir
kontinyu, shg tetap
ditambahkan pelarut baru
dari bagian atas kolom
sehingga kolom tidak
pernah kering.
Pengisian kolom :

Harus seragam

Setelah adsorben dimasukkan dapat

diseragamkan kepadatannya dengan vibrator.

Adsorben dapat dimasukkan dalam bentuk

larutan (slurry) dan partikelnya dibiarkan
mengendap.

Bagian bawah isian kolom diberi wol kaca

(glass wool) dan sintered glass disc untuk
menyangga isian.
Cara Memasukkan Zat Penyerap
(Adsorben) ke dalam Kolom

Metode kering
Metode Bubur
Metode Basah
Metode Kering
Zat penyerap dimasukkan secara langsung
ke dalam kolom kromatografi. Penambahan
secara sedikit demi sedikit dengan hati-hati
sambil kolom diketuk-ketuk.
Pelarut atau fase gerak dituang sedikit-sedikit
dan tutup kolom dibuka sampai cairan
menetes. Kran ditutup kembali apabila
permukaan cairan kira-kira 1 cm diatas
permukaan adsorben.
Metode Bubur
Zat penyerap dicampur dengan pelarut didalam beker
gelas, kemudian dituang ke dalam kolom yang telah diisi
dengan pelarut setinggi 2/3 dari kolom.
Dasar kolom sudah disumbat dengan serabut gelas atau
kapas dan bila perlu ditambah bahan penyaring guna
mencegah pengadukan terhadap zat penyerap sewaktu
berlangsung penambahan pelarut.
Tinggi pelarut tidak mencegah terjadinya retakan pada
lapisan zat penyerap yang mungkin menyebabkan
gangguan terhadap elusi.
Video Metode Bubur
Metode Basah
Zat penyerap dituang langsung ke dalam
kolom yang telah diberi pelarut sambil kolom
diketuk-ketuk untuk menghilangkan
gelembung udara.
 Tahapan Kromatografi Kolom :
Profil KLT

Dst hingga diperoleh senyawa tunggal

33