KROMATOGRAFI

KOLOM
 PENDAHULUAN
• Arti Kata Kromatografi
– chroma berarti warna dan graphien berarti menulis

• Sejarah Kromatografi
– Sejarah kromatografi dimulai sejak pertengahan abad ke 19 ketika
penggunaan teknik pemisahan pigmen tanaman seperti klorofil.
– Hasilnya berupa pita-pita berwarna yang terlihat sepanjang kolom sebagai
hasil pemisahan komponen-komponen dalam ekstrak tumbuhan.

• Sejarah Kromatografi Kolom

– Sebenarnya kromatografi kolom merupakan teknik kromatografi yang paling
awal yang pertamakali di lakukan oleh D.T.Davy (1987) yaitu untuk
membedakan komposisi minyak bumi.
– Michael Tswett di tahun 1901, ketika dia mencuci larutan organik dari pigmen
tumbuhan melalui kolom gelas vertical yang diisi dengan materi yang dapat
mengabsorbsi.
 Pengertian Kromatografi
Kromatografi secara umum.
Kromatografi adalah teknik untuk memisahkan
campuran menjadi komponennya dengan bantuan
perbedaan sifat fisik masing-masing komponen.
Pengertian
Kromatografi kolom adalah suatu teknik
pemisahan molekul berdasarkan perbedaan
pola pergerakan antara fase gerak dan fase
diam untuk memisahkan komponen pada
sampel.
 Prinsip Kerja Kromatografi Kolom

• Didasarkan pada absorbsi komponen2 campuran dengan

afinitas berbeda terhadap permukaan fase diam.
• Absorben bertindak sebagai fase diam dan fase geraknya
adalah cairan yang mengalir membawa komponen
campuran sepanjang kolom.
• Sampel yang mempunyai afinitas besar terhadap absorben
akan secara selektif tertahan dan afinitasnya paling kecil
akan mengikuti aliran pelarut.
● Prinsip kerjanya sama dengan kromatografi
lapis tipis
● Dilaksanakan dalam suatu kolom yang diisi
dengan fase stasioner yg porous
● Digunakan cairan sbg fase mobil u/mengelusi
komponen sampel keluar dari kolom
● Kolom digunakan untuk memurnikan
senyawa / pemisahan campuran
● Dapat diterapkan pada skala besar
Prisip dasar
Apabila eluen dialirkan secara kontinyu melalui
kolom yang berisi zat contoh yang telah diadsorbsi
oleh adsorben, maka komponen yang pertama
keluar adalah komponen yang paling lemah terikat
pada adsorben. Komponen lainnya akan keluar
sesuai dengan urutan afinitasnya terhadap
adsorben sehingga terjadi pemisahan komponen-
komponen tersebut.
JENIS KROMATOGRAFI KOLOM
● Kromatografi Adsorbsi, komponen yang
dipisahkan secara selektif teradsorbsi pada
permukaan adsorben yang dipakai untuk bahan
isian kolom.
● Kromatografi Partisi, komponen mengalami partisi
antara lapisan cairan tipis pada penyangga padat
yang bertindak sebagai fase diam & eluen yg
bertindak sebagai fase gerak.
● Kromatografi Pertukaran Ion, memisahkan
komponen yang berbentuk ion yg terikat pada
penukar ion sebagai fase diam secara selektif
akan terlepas/terelusioleh oleh fasa gerak.
● Kromatografi Filtrasi Gel, kolom diisi dengan gel
yang permeabel sebagai fase diam dan
pemisahan berlangsung seperti proses
pengayakan yang didasarkan pd ukuran molekul
dari komponen yang dipisahkan.
 Fasa pada Kromatografi Kolom
1. Fasa Gerak
– Fase yang mengalir melalui kolom dan merupakan fase yang akan melarutkan
zat komponen campuran
– Fase gerak pada kromatografi kolom dapat berupa pelarut
tunggal atau campuran beberapa pelarut dengan komposisi tertentu
– Contoh : Perfluorokarbon,Hidrokarbonjenuh, Hidrokarbontak jenuh,
Halida & eter, Aldehid & keton, Alkohol & thiol, Asam & basa

2. Fasa Diam
‒ Fase yang akan menahan komponen campuran.
‒ Fasa diam berupa adsorben yang tidak boleh larut dalam fasa gerak, ukuran
partikel fasa diam harus seragam.
‒ Contoh : Alumina, silika gel, arang, bauksit, magnesium karbonat, talk, pati,
selulosa, dll.
KROMATOGRAFI ADSORBSI
● Zat padat sebagai adsorben / fase diam
(stasioner phase)
✔ Alumina & silika gel paling populer
✔ Urutan kemampuan adsorbsi besar ke kecil :
▪ Alumina
▪ Charcoal
▪ Silika gel
▪ Magnesium
▪ Kalium karbonat
▪ Sukrosa
▪ Starch
▪ Selulosa
● Zat cair sebagai fase gerak (mobile phase)
✔ Zat pelarut yg mampu melakukan elusi terlalu cepat tdk
mampu memisahkan dengan baik
✔ Elusi yang terlalu lambat menyebabkan waktu retensi yg
terlalu lama
● Kolom kromatografi bekerja berdasarkan skala
yang lebih besar menggunakan material
terpadatkan pada sebuah kolom gelas vertikal.
PENGISIAN & CARA KERJA KOLOM

● Pemasukan absorben ke dalam kolom.

● Kepadatan diseragamkan dengan
vibrator/plunger/ dalam bentuk larutan (slurry)
& partikelnya dibiarkan mengendap.
● Fungsi glass wool di atas & dasar kolom sbg
penyangga isian.
● Kecepatan elusi dibuat konstan 1 cm/mnt
Penyiapan dan pengisian
kolom
● Adsorben dapat dikemas dalam kolom
dengan cara kering maupun basah.
1. Cara Kering
● Sedikit pasir/glasswoll/penahan adsorben
yang lain diletakkan ke dalam kolom
●  Adsorben dituang sedikit demi sedikit. Setiap
kali setelah penambahan adsorben,
permukaan diratakan dan dimampatkan
dengan alat pemampat.
● Jika semua adsorben telah dimasukkan,
di permukaan atas diletakkan kertas
saring dan ditambahkan sedikit pasir lagi
untuk menjaga kerataan permukaan
adsorben jika eluen dialirkan.
● Eluen dialirkan dari atas kolom dengan
kran kolom terbuka sehingga
memungkinkan eluen meresap hingga
ujung akhir kolom.
● Setelah eluen mencapai ±1 cm di atas
permukaan adsorben, maka kran ditutup
dan aliran eluen dihentikan.
2. Cara Basah
● Adsorben dicampur dengan eluen untuk dibuat
bubur (slurry) terlebih dahulu.
● Bubur adsorben dimasukkan ke dalam kolom yang
telah berisi eluen ± 1/3 panjang kolom
●Selama adsorben turun perlahan, kolom diketuk-
ketuk pada semua sisi secara perlahan-lahan dengan
ball pipet karet atau bahan lain yang tidak keras. Hal
ini dilakukan agar partikel-partikel adsorben dapat
menyusun diri dengan kerapatan yang sama
sehingga diperoleh lapisan yang homogen
●Sepotong kertas saring dan selapis pasir diletakkan
di atas adsorben untuk menjaga kerataan permukaan
adsorben
Partikel-partikel adsorben harus mengisi
kolom dengan kerapatan yang sama atau
homogen sebab pengisian kolom yang tidak
teratur dapat merusak batas-batas pita
kromatografi. Selain itu pengisian yang
tidak homogen dapat pula disebabkan oleh
adanya gelembung-gelembung udara saat
pengisian. Oleh karena itu saat pembuatan
bubur, adsorben harus diaduk-aduk dan
dicuci secara berulang dengan eluen untuk
menghilangkan gelembung udara.
● Penggunaan kolom

⮚ Untuk memisahkan campuran senyawa

dengan membuat larutan jenuh dari
campuran menggunakan pelarut yang
lebih disukai dalam kolom.

⮚ Membuka kran penutup untuk

membiarkan pelarut yang sudah berada
dalam kolom mengering sehingga
material terpadatkan rata pada bagian
atas

⮚ Menambahkan larutan secara hati-hati

dari bagian atas kolom. Kmdn kran
dibuka kembali sehingga senyawa
campuran akan diserap pada bagian
atas material terpadatkan, sehingga
akan tampak seperti gambar brkt ini:
● Selanjutnya ditambahkan
pelarut baru melalui
bagian atas kolom &
cegah sedapat mungkin
jangan sampai merusak
material terpadatkan
dalam kolom.
● Kemudian kran dibuka,
supaya pelarut dapat
mengalir melalui kolom
● Pelarut dikumpulkan
dalam satu gelas kimia
atau labu dibawah kolom.
● Pelarut mengalir
kontinyu, sehingga tetap
ditambahkan pelarut baru
dari bagian atas kolom
sehingga kolom tidak
pernah kering.
Mekanisme Pemisahan

● Proses terbawanya sampel dari puncak

kolom sampai akhir kolom hingga memisah
menjadi komponen-komponennya disebut
elusi. Pemisahan terjadi karena komponen
sampel lebih banyak tertahan oleh adsorben
atau dibawa oleh eluen, tergantung dari
kecenderungan komponen tersebut terhadap
kedua fase.
● Elusi dapat dilakukan secara isokratik
maupun gradien:
1. Elusi isokratik
Pada elusi isokratik, eluen yang digunakan
selama elusi selalu sama (1 jenis eluen).
Elusi digunakan dari awal proses
kromatografi kolom hingga diperoleh
komponen-komponen yang terpisah.

        
2. Elusi gradien
Elusi yang digunakan lebih dari 1 jenis eluen.
Pada saat proses elusi, dapat dilakukan
penggantian eluen. Jika komponen yang
dikehendaki telah terpisah dari campuran,
namun masih ada komponen lain yang belum
terpisah (sulit terpisah dengan eluen yang
mula-mula digunakan), maka eluen dapat
diganti untuk mengeluarkan komponen
tersebut dengan cara menambahkan eluen
baru ke dalam kolom.
Setelah sampel dituang pada puncak kolom,
dengan segera sampel akan terdistribusi di antara
kedua fase pada puncak kolom. Dengan adanya
aliran eluen, maka eluen yang mengandung
sebagian sampel akan terdesak ke bagian bawah
kolom sehingga akan terjadi distribusi antara eluen
dan adsorben. Pada waktu yang bersamaan,
distribusi baru juga terjadi pada puncak kolom
antara eluen yang baru dengan adsorben yang
telah mengandung sebagian sampel.
Karena komponen-komponen sampel hanya dapat
bergerak bersama eluen, maka kecepatan
bergerak dari satu komponen tergantung pada
lamanya komponen berada dalam eluen, dimana
hal tersebut bergantung pada seberapa besar
komponen tertambat pada adsorben. Pemisahan
terjadi karena komponen sampel lebih banyak
tertahan oleh fase diam atau terbawa oleh fase
gerak, tergantung pada afinitas komponen
terhadap kedua fase.
Identifikasi komponen terpisah
Karena kromatografi kolom hanya dapat
digunakan untuk memisahkan komponen,
maka identifikasi komponen terpisah dapat
dilakukan dengan berbagai metode identifikasi
yang lain, diantaranya adalah dengan
melakukan kromatografi kertas atau KLT
terhadap komponen yang terpisah, atau dapat
juga dilakukan analisis secara spektrofotometri
untuk mengetahui kadar masing-masing
komponen yang terpisah.
 Aplikasi Kromatografi Kolom
• Analisis senyawa-senyawa kimia bahan alam
• Bidang pertanian
• Pemisahan molekul-molekul penting seperti asam
nukleat, karbohidrat, lemak, vitamin dan molekul penting
lainnya
 Kelemahan dan Keunggulan Kromatografi
Kolom

• Kelebihan Kromatografi Kolom :

– Dapat digunakan untuk analisis dan aplikasi preparatif
– Digunakan untuk menentukan jumlah komponen campuran karena
komponen- komponen penyusunnya akan terpisahkan pada saat elusi
berlangsung.
– Dapat digunakan untuk analisis dan aplikasi preparative
– Digunakan untuk menentukan jumlah komponen campuran
– Digunakan untuk memisahkan dan purifikasi substansi

• Kekurangan Kromatografi Kolom :

– Untuk mempersiapkan kolom dibutuhkan kemampuan teknik dan manual.
– Membutuhkan waktu yang lama