Metode Pemisahan

Senyawa Bahan Alam

.
Tahapan Pemisahan:
Bahan • Pengolahan bahan (sortasi,
Tanama pencucian, pemotongan,
pengeringan)
n

Simplisi • Ekstraksi
a

Ekstrak • Fraksinasi

Fraksi • Isolasi

Isolat
Bahan uji
Bahan tumbuhan yang digunakan:
• Jaringan tumbuhan segar
• Simplisia (kering)
EKSTRAKSI
Ekstraksi
adalah proses pengambilan komponen yang larut dari bahan atau
campuran dengan menggunakan pelarut seperti air, alkohol, eter,
aseton dan sebagainya.
Metode ekstraksi
Berdasarkan suhu yang digunakan,dibagi menjadi:
1. Ekstraksi cara dingin
• Maserasi
• Perkolasi
2. Ekstraksi cara panas
• Reflux
• Infundasi
• Dekoktasi
• Ekstraksi dengan alat Soxhlet
• Destilasi
Maserasi

• Penyarian zat aktif yang dilakukan dengan cara

merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari yang
sesuai selama tiga hari pada temperatur kamar
terlindung dari cahaya, cairan penyari akan masuk ke
dalam sel melewati dinding sel.
• Isi sel akan larut karena adanya perbedaan konsentrasi
antara larutan di dalam sel dengan di luar sel. Larutan
yang konsentrasinya tinggi akan terdesak keluar dan
diganti oleh cairan penyari dengan konsentrasi rendah
( proses difusi ). Peristiwa tersebut berulang sampai
terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar
sel dan di dalam sel.
• Selama proses maserasi dilakukan pengadukan dan
penggantian cairan penyari setiap hari. Endapan yang
diperoleh dipisahkan dan filtratnya dipekatkan.
Perkolasi
• Perkolasi adalah cara penyarian dengan mengalirkan penyari
melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi.
• Keuntungan metode ini adalah tidak memerlukan langkah
tambahan yaitu sampel padat (marc) telah terpisah dari
ekstrak.
• Kerugiannya adalah kontak antara sampel padat tidak merata
atau terbatas dibandingkan dengan metode refluks, dan
pelarut menjadi dingin selama proses perkolasi sehingga tidak
melarutkan komponen secara efisien.
Perbedaan maserasi dan perkolasi:

• Pada maserasi pengekstrasian memakai pelarut dengan

beberapa kali pengadukan pada suhu kamar sedangkan pada
perkolasi ekstraksi dilakukan dengan menggunakan pelarut
yang selalu baru sampai sempurna (exhaustive extraction)
• Ekstrak yang dihasilkan lebih banyak dengan cara perkolasi
dibandingkan maserasi .
• Pada perkolasi tidak terdapat keseimbangan konsentrasi
seperti maserasi karena pelarut yang digunakan selalu
berubah (baru) sehingga keseimbangan konsentrasi selalu
baru.
Reflux

• Penarikan komponen kimia yang dilakukan dengan

cara sampel dimasukkan ke dalam labu alas bulat
bersama-sama dengan cairan penyari lalu
dipanaskan, uap-uap cairan penyari terkondensasi
pada kondensor bola menjadi molekul-molekul
cairan penyari yang akan turun kembali menuju labu
alas bulat, akan menyari kembali sampel yang
berada pada labu alas bulat, demikian seterusnya
berlangsung secara berkesinambungan sampai
penyarian sempurna, penggantian pelarut dilakukan
sebanyak 3 kali setiap 3-4 jam. Filtrat yang diperoleh
dikumpulkan dan dipekatkan.
Infundasi/Dekoktasi
• Infundasi merupakan metode ekstraksi dengan pelarut air.
Pada waktu proses infundasi berlangsung, temperatur pelarut
air harus mencapai suhu 90ºC selama 15 menit.
Rasio berat bahan dan air adalah 1 : 10, artinya jika berat bahan 100
gr maka volume air sebagai pelarut adalah 1000 ml.

• Dekoktasi merupakan proses ekstraksi yang mirip dengan

proses infundasi, hanya saja infuns yang dibuat membutuhkan
waktu lebih lama (≥ 30 menit) dan suhu pelarut sama dengan
titik didih air.
Ekstraksi dengan alat Soxhlet
• Soxhletasi merupakan
penyarian simplisia secara
berkesinambungan, cairan
penyari dipanaskan sehingga
menguap, uap cairan penyari
terkondensasi menjadi
molekul-molekul pelarut
oleh pendingin balik dan
turun menyari simplisia
dalam klongsong dan
selanjutnya masuk kembali
ke dalam labu alas bulat
setelah melewati pipa .
Keuntungan metode ini adalah :
• Dapat digunakan untuk sampel dengan tekstur yang lunak dan tidak tahan
terhadap pemanasan secara langsung.
• Digunakan pelarut yang lebih sedikit
• Pemanasannya dapat diatur

Kerugian dari metode ini :

• Karena pelarut didaur ulang, ekstrak yang terkumpul pada wadah di sebelah
bawah terus-menerus dipanaskan sehingga dapat menyebabkan reaksi peruraian
oleh panas.
• Jumlah total senyawa-senyawa yang diekstraksi akan melampaui kelarutannya
dalam pelarut tertentu sehingga dapat mengendap dalam wadah dan
membutuhkan volume pelarut yang lebih banyak untuk melarutkannya.
• Bila dilakukan dalam skala besar, mungkin tidak cocok untuk menggunakan
pelarut dengan titik didih yang terlalu tinggi, seperti metanol atau air, karena
seluruh alat yang berada di bawah komdensor perlu berada pada temperatur ini
untuk pergerakan uap pelarut yang efektif.
Destilasi
• Destilasi uap adalah metode
yang popular untuk ekstraksi
minyak-minyak menguap
(esensial) dari sampel
tanaman

• Metode destilasi uap air

diperuntukkan untuk menyari
simplisia yang mengandung
minyak menguap atau
mengandung komponen kimia
yang mempunyai titik didih
tinggi pada tekanan udara
normal.
PEMISAHAN: FRAKSINASI/ISOLASI
Pemisahan: Fraksinasi-Isolasi
• Cara pemisahan:
1. Dengan pelarut
2. Kromatografi: Kromatografi kolom, fast chromatography, KLT,
KK, KGC, HPLC
3. Elektroforesis
Ekstraksi Cair-Cair

• Ekstraksi cair-cair adalah pemisahan

komponen dari suatu campuran cair
dengan mengontakkan pada cairan lain
• Pemisahan berdasar perbedaan kelarutan
• Senyawa-senyawa yang bersifat polar
akan ditemukan di dalam fase air,
sementara senyawa-senyawa yang
bersifat hidrofobik akan masuk pada
pelarut organik.
 Kromatografi

Padat Fasa
Fasa Diam
Pertukaran Ion Diam Gel

Gas Cair Cair Fasa Gerak Cair

Anion Kation GPC

Plat Kolom
Kromatografi Kolom
• Mekanisme
pemisahan
kromatografi kolom
merupakan
kromatografi serapan
atau adsorpsi
Fasadiam: Fasagerak:
• Berupa adsorben yang • Dapat berupa pelarut
tidak boleh larut dalam tunggal atau
fasa gerak,
campuran beberapa
• Ukuran partikel fasa
pelarut dengan
diam harus seragam.
komposisi tertentu.
• Pelarut dapat
Contoh:alumunium,silicag
el,arang, bauksit,
merupakan pelarut
magnesium karbonat, talk, polar dan Pelarut
pati, dan selulosa. nonpolar.
JENIS KROMATOGRAFI KOLOM
• Kromatografi Adsorbsi, komponen yg dipisahkan scr selektif
teradsorbsi pd permukaan adsorben yg dipakai u/bhn isian
kolom.
• Kromatografi Partisi, komponen mngalami partisi antara
lapisan cairan tipis pd penyangga padat yg bertindak sbg
fase stasioner & eluen yg bertindak sbg fase gerak (mobil).
• Kromatografi Pertukaran Ion, memisahkan komponen yg
berbentuk ion yg terikat pd penukar ion sbg fase stasioner
scr selektif akan terlepas/terelusioleh fase mobile.
• Kromatografi Filtrasi Gel, kolom diisi dg gel yg permeabel
sbg fase stasioner, dan pemisahan berlangsung spt proses
pengayakan yg didasarkan pd ukuran molekul dr komponen
yg dipisahkan.
KROMATOGRAFI ADSORBSI

• Zat padat sbg adsorben / fase stasioner

 Alumina & silika gel paling populer
 Urutan dr kemampuan adsorbsi bsr ke kcl :
 Alumina
 Charcoal
 Silika gel
 Magnesium
 Kalium karbonat
 Sukrosa
 Starch
 Selulosa
• Zat cair sbg fase mobile
 Zat pelarut yg mampu mlakukn elusi terlalu cepat tdk mampu
memisahkan dg baik
 Elusi yg terlalu lambat mnyebabkan waktu retensi yg trlalu lama
 Golongan pelarut yg diurutkan dg dasar kenaikan adsorbilitasnya
pd kolom alumina :
 Perfluorokarbon
 Hidrokarbon jenuh
 Hidrokarbon tak jenuh
 Halida & eter
 Aldehid & keton
 Alkohol & thiol
 Asam & basa
• Kolom kromatografi bekerja berdasarkan skala yang lebih
besar menggunakan material terpadatkan pada sebuah
kolom gelas vertikal.
PENGISIAN & CARA KERJA KOLOM

• Pemasukan absorben kedlm kolom.

• Kepadatan diseragamkan dg vibrator/plunger/ dlm bntuk larutan
(slurry) & partikelnya dibiarkan mngendap.
• Fungsi glass wool di atas & dasar kolom sbg penyangga isian.
• Kecepatan elusi dibuat konstan 1 cm/mnt
• Penggunaan kolom

u/memisahkan campuran dari dua senyawa

dg membuat larutan jenuh dari campuran
menggunakan pelarut yang lebih disukai
dalam kolom.

Membuka kran penutup untuk membiarkan

pelarut yang sudah berada dalam kolom
mengering sehingga material terpadatkan
rata pada bagian atas
Menambahkan larutan secara hati-hati dari
bagian atas kolom. Kmdn kran dibuka
kembali sehingga senyawa campuran akan
diserap pada bagian atas material
terpadatkan, sehingga akan tampak seperti
gambar brkt ini:
• Selanjutnya ditambahkan
pelarut baru melalui bagian
atas kolom & cegah sedapat
mungkin jangan sampai
merusak material
terpadatkan dalam kolom.
• Kmdn kran dibuka, supaya
pelarut dapat mengalir
melalui kolom
• Pelarut dikumpulkan dalam
satu gelas kimia atau labu
dibawah kolom.
• Pelarut mengalir kontinyu,
shg tetap ditambahkan
pelarut baru dari bagian
atas kolom sehingga kolom
tidak pernah kering.
Dalam perkembangan selanjutnya, terutama untuk sampel yang
sangat kecil metode kromatografi kolom dikembangkan untuk:
1.Kromatografi gas (GC) dan
2.Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT).
• Fase stasioner berupa cairan, fase mobile dpt brp :
Cairan (HPLC = High Performance Liquid Chromatography)
Gas (GLC = Gas Liquid Chromatography)

• Kelebihan HPLC :
Daya ulangnya lebih baik.
Dari data kelarutan,hslnya dapt diprediksikan
Dpt menghasilkan puncak yg simetris dan lebih tajam
u/senyawa yg stabilitas thd suhu terbatas
Mrpkn teknik analisis yg peka & dpt memisahkan senyawa yg
sangat serupa dg resolusi yang baik.
Waktu pemisahan singkat 5-10 mnt
U/analisa kuantitatif
FASE STASIONER
• Ada 2 tipe bhn isian yaitu :
Pellicular beads
o Bgn dlm padat tdk berpori
o Dr silika
Microporous particle
 Ukurannya kcl 3-10mm shg luas prmukaan besar
 Effisiensi tinggi krn jmlh plat teoritik 10.000 dlm kolom 25 cm.
• Pelarut lebih polar sbg fase stasioner (= kromatografi fase
normal)
• Pelarut non polar (krom fase terbalik)
HPLC FASE NORMAL (Kolom dan pelarut)

a. Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan

pelarut non polar misalnya heksan. Sebuah kolom
sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan
mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150
sampai 250 mm.

b. Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom

akan melekat lebih lama pada silika yang polar
dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh
karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan
lebih cepat melewati kolom.
• Fase balik HPLC

a. ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi

non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon
panjang pada permukaannya secara sederhana baik
berupa atom karbon 8 atau 18.

b. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa

campuran air dan alkohol seperti metanol.
KOLOM
• Panjang 10-25 cm dan diameter 4,5-5,0 mm yg diisi dg fase
stationer berukuran rata-rata 5-10mmdr bahan stainless steel
DETEKTOR
• Mempunyai sensitivitas yg tinggi
• Bersifat linear u/jangka konsentrasi tertentu
• Dapat mendeteksi eluent tanpa mempengaruhi resolusi
kromatogam
• Tdk terlalu peka terhadap perubahan berbagai parameter terutama
suhu & tekanan
MACAM DETEKTOR
• Detektor UV
 Sebagian senyawa punya serapan khusus di daerah
UV & sinar tampak
 Pengukuran scr kuantitatif berdasar hk Lambert-Beer yg
mngubkan besaran absorbansi dg konsentrasi solute.
 Hrs digunakan sinar monoromatik/dg panj.gel sempit (2-4 nm)
 Tipe detektor dg daerah deteksi UV (200-400nm) dan sinar
tampak (400-700 nm) tlh ada shg dpt mndeteksi hmpr semua
senyawa organik.
• Detektor Fluoresensi
u/senyawa yg fluoresen
Bersft spesifik dan lbh selektif
Sgt peka & dpt mndeteksi kdar senyawa yg sgt kcl spt aflatoksin,
seny aromatik berinti byk, vitamin ttt & derivat asam amino
Kelemahannya krn kepekaan thd senyawa asing sbg kontaminan
dlm eluen yg dpt mngganggu kuantifikasi senyawa yg diukur.
• Detektor Konduktivitas
 Prinsip kerja mngukur konduktivitas eluen dari kolom
 u/mngukur senyawa yg bersft ionik
 Perlu dihindari pnggunaan buffer ion krn mpnyai konduktivitas yg
tinggi
• Detektor Indeks Refraksi
Prinsip krja perubahan nilai indeks refraksi dr suatu cairan yg
mngalir
u/ analisis gula dan lemak
• Detektor FID (Flame Ionization Detector)
 Senyawa pelarut dihilangkan dahulu
 Dianalisa senyawa yg target
 Eluen dr kolom dialirkan pd permukaan kawat ke evaporator
kmdn ke alat pirolisis dan ke FID
Diagram alir HPLC
Waktu retensi
• Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui
kolom menuju detektor.
• Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel
diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak
yang maksimum dari senyawa itu.
• Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang
berbeda.
Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat
bervariasi dan bergantung pada:

• tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada

laju alir dari pelarut)
• kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa,
tetapi juga pada ukuran partikel)
• komposisi yang tepat dari pelarut
• temperatur pada kolom
Kromatografi Cair Vakum

• Kromatografi cair-vakum merupakan kromatografi

kolom yangdikemas kering biasanya dengan
penyerap mutu kromatografi lapis tipis10-4 µg
pada kondisi vakum, fase gerak digerakkan dengan
kondisi vakum sehingga prosesnya berlangsung
cepat.
• Kromatografi vakum cair dilakukan untuk
memisahkan golongan senyawa metabolit
sekunder secara kasar dengan menggunakan silika
gel sebagai absorben dan berbagai perbandingan
pelarut n-heksana : etil asetat : metanol (elusi
gradien) dan menggunakan pompa vakum untuk
memudahkan penarikan eluen (Helfman, 1983).
Kromatografi Lapis Tipis
• Pemisahan komponen kimia • 
berdasarkan prinsip adsorbsi
dan partisi, yang ditentukan
oleh fase diam (adsorben) dan
fase gerak (eluen), komponen
kimia bergerak naik mengikuti
fase gerak karena daya serap
adsorben terhadap komponen-
komponen kimia tidak sama
sehingga komponen kimia dapat Parameter: Nilai Rf
bergerak dengan kecepatan
yang berbeda berdasarkan
tingkat kepolarannya, hal inilah
yang menyebabkan terjadinya
pemisahan.
Kecepatan gerak senyawa-senyawa ke atas pada lempengan itu
tergantung pada:
• Bagaimana kelarutan senyawa dalam pelarut. Hal ini
bergantung pada bagaimana besar atraksi antara molekul-
molekul senyawa dengan pelarut.
• Bagaimana senyawa melekat pada fase diam, misalnya silika
gel
• Hal ini tergantung pada bagaimana besar atraksi antara
senyawa dengan silika gel.
• Mrpkn kromatografi adsorbsi dan adsorben bertindak sbg fase
stasioner.

• Dapat digunakan untuk memisahkan :

 ion-ion organik
 komplek senyawa organik dg anorganik
 senyawa organik alami dan sintetis

• Pemisahan lebih sempurna, kepekaan tinggi dan dpt dilakukan dg

cepat
Silika gel
• Silika Gel G
 mengandung 13% Kalsium Sulfat sebagai zat perekat
 biasanya mengandung ion logam (besi) dihilangkan dg pelarut
metanol : asam HCl pekat = 9 : 1
• Silika Gel H
 digunakan untuk pemisahan yang spesifik, terutama lipida
netral.
 dpt memisahkan berbagai digliserida spt 1,2 digliserida dari
1,3 digliserida; fosfatidil gliserol dari poligliserida fosfat.
• Silika Gel PF
 senyawa organik yg terikat dpt berfluoresensi.
 Visualisasi dan Identifikasi
• Untuk melihat komponen penyusun yg sudah
terpisah setelah proses pengembangan
• Bersifat destruktif dan non destruktif
o destruktif akan merusak sampel secara irreversible (u/
pengukuran kuanti & kualitatif)
o nondestruktif baik u/KLT preparatif & pengukuran kuantitatif
• Bersifat umum dan spesifik
• Identifikasi
o membandingkan posisi spot dg senyawa standar
o visualisasi khusus (mis. Dg ninhidrin, senyawa yg
mengandung gugus amino akan menunjukkan spot kuning
jingga)
 Visualisasi dan Identifikasi
• Sinar UV 254 nm
Pada UV 254 nm, lempeng akan berflouresensi sedangkan sampel akan tampak berwarna
gelap.Penampakan noda pada lampu UV 254 nm adalah karena adanya daya interaksi antara sinar UV
dengan indikator fluoresensi yang terdapat pada lempeng. Fluoresensi cahaya yang tampak merupakan
emisi cahaya yang dipancarkan oleh komponen tersebut ketika elektron yang tereksitasi dari tingkat energi
dasar ke tingkat energi yang lebih tinggi kemudian kembali ke keadaan semula sambil melepaskan energi.

• Sinar UV 366 nm
Pada UV 366 nm noda akan berflouresensi dan lempeng akan berwarna gelap. Penampakan noda pada
lampu UV 366 nm adalah karena adanya daya interaksi antara sinar UV dengan gugus kromofor yang
terikat oleh auksokrom yang ada pada noda tersebut. Fluoresensi cahaya yang tampak merupakan emisi
cahaya yang dipancarkan oleh komponen tersebut ketika elektron yang tereksitasi dari tingkat energi dasar
ke tingkat energi yang lebih tinggi kemudian kembali ke keadaan semula sambil melepaskan energi.
Sehingga noda yang tampak pada lampu UV 366 terlihat terang karena silika gel yang digunakan tidak
berfluororesensi pada sinar UV 366 nm.

• Pereaksi Semprot H2SO4 10%

Prinsip penampakan noda pereaksi semprot H2SO4 10% adalah berdasarkan kemampuan asam sulfat
yang bersifat reduktor dalam merusak gugus kromofor dari zat aktif simplisia sehingga panjang
gelombangnya akan bergeser ke arah yang lebih panjang (UV menjadi VIS) sehingga noda menjadi tampak
oleh mata.
• Uap iodium
 Spot akan berwarna coklat dg dasar putih
 Tidak merusak komponen yg telah terpisah
 Dpt digunakan u/semua senyawa organik yg tidak jenuh (dg
ikatan rangkap)

• Charring
 penyemprotan plat dg lar H2SO4/K2Cr2O7 kmdn dipanaskan pd
suhu 125oC
 Zat organik akan mengalami oksidasi menjadi karbon yang
berwarna hitam
 Reagen Spesifik

• Untuk mendeteksi secara kualitatif & mengenal adanya gugus

tertentu dalam senyawa yg dipisahkan.
• Reagensia ini bersifat destruktif
• Anilin pthalat
• Spot yg terdiri dari gula-gula reduksi akan memberikan
berbagai warna
• Anisaldehid dlm H2SO4 dan HOAc
• Senyawa ini untuk menunjukkan adanya karbohidrat.
• Karbohidrat menunjukkan warna biru
• Antimon triklorida dalam CHCl3
• Senyawa ini mendeteksi adanya senyawa steroid, steroid
glikosida,lipida alifatik,dan vit A.
• Zat tsb dg UV akan menunjukkan berbagai warna tertentu
• Bromokresol jambon
• Untuk pengenalan ion-ion halogen kec. F & asam
dikarboksilat
• Senyawa tsb akan menunjukkan warna kunin atau jingga
• Bromokresol hijau
• Pengenal asam karboksilat
• Senyawa tersebut akan memberikan warna kuning/jingga
• 2,4 Dinitrofenilhidrazin (2,4 DPNH)
• Pengenal aldehid dan keton yg akan membentuk warna
kuning sampai kemerahan.
• Dragendorf
• Pengenal berbagai alkaloid dan basa organik (mberikan
warna orange)
• Feri Klorida
• Senyawa fenol & menunjukkan berbagai warna.
• Fluorescein-Br2
• Pengenal senyawa organik tidak jenuh ( Dg UV akan
menunjukkan warna tertentu)
• 8-Hidroksiquinolin-NH3
• Pengenal kation anorganik (dg UV akan terlihat
berbagai warna)
• Ninhidrin
• Gugus amino akan berwarna biru.
Kromatografi Kertas
• Kromatografi kertas • Fasa diam didukung oleh suatu
zat padat berupa bubuk selulosa.
merupakan salah Fasa diam merupakanzat cair
satu metode yaitu molekul H2O yang
teradsorpsi dalam selulosa
pemisahan kertas.
berdasarkan • Fasa gerak berupa campuran
pelarut yang akanmendorong
distribusi suatu senyawa untuk bergerak
senyawa pada dua disepanjang kolom kapiler.
Analisis kualitatif menggunakan
fasayaitu fasa diam kromatografi kertasdilakukan
dan fasa gerak. dengan cara membandingkan
harga relative response factor
(Rf).
tugas
• Sebutkan dan
Jelaskan macam-
macam instrumen
yang menggunakan
tehnik kromatografi
Pustaka
• Ditjen POM, (1986), "Sediaan Galenik", Departemen
Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.
• Wijaya H. M. Hembing (1992), ”Tanaman Berkhasiat Obat di
Indonesia”, Cet 1 , Jakarta .
• Sudjadi, (1986), "Metode Pemisahan", UGM Press, Yogyakarta
• Gritter, Roy J. et.al. 1991. Kromatografi. Ed. 2. Penerbit ITB,
Bandung.
• Alam, Gemini dan Abdul Rahim. 2007. Penuntun Praktikum
Fitokimia. UIN Alauddin: Makassar. 24-26.
• Stahl, Egon. 1985. Analisis Obat Secara Kromatografi dan
Mikroskopi. ITB: Bandung. 3-5.