METODE

FITOKIMA

By : Dewy Resty B, S.Farm.Apt

EKSTRAKSI
• Pengambilan bahan aktif dari tumbuhan dengan
pelarut tertentu
FAKTOR-FAKTOR YANG BERPENGARUH
• Bahan Awal (sampel)

• Pelarut (menstrum)

• Cara/Metode
 Bahan Awal
SEGAR KERING

BUAH FRUCTUS
DAUN/FOLIUM
BIJI/SEMEN
HERBA
BATANG/CAULIS
RIMPANG/RHIZOMA
KULIT KAYU/KORTEKS
KAYU/LIGNUM
PELARUT
• Selektifitas
• Mudah penangannya
• Ekonomis
• Ramah lingkungan
JENIS-JENIS PELARUT
• Air
• Hidrokarbon alifatis (PE, heksan)
• Kloro hidrokarbon (Diklormetan, Triklormetan)
• Alkohol (Etanol, Metanol, Isopropanol)
• Asam Karboksilat
• Ester
• Eter
• Minyak
3 METODE EKSTRAKSI
• Proses yg menghasilkan keseimbangan
konsentrasi antara larutan dan residu padat
contoh : Maserasi, digesti, ultrasonic estraction
• Proses ekstraksi seksama/menyeluruh
contoh : Perkolasi, Countercurrent extraction
• Ekstraksi dengan gas superkritis
MACERATION
• Penyarian dengan menggunakan pelarut beberapa
hari (5 hari) dengan pengadukan (tidak kontinyu)
• Sesuai untuk bahan aktif yang mudah larut dalam
cairan penyari
• Simplisia yang mengandung mucilago dan bahan
lain yang mudah mengambang
Cara pengerjaan dan peralatan sangat sederhana
dan murah
Pengerjaan lama dan penyarian kurang sempurna
• Kinetic Maceration : maserasi dg pengadukan
konstan dan kontinu
• Digesti : Maserasi dengan pemanasan (40-50 C)
VORTICAL (TURBO) EXTRACTION
• Bahan dan pelarut diaduk dengan kecepatan
tinggi (high speed mixer/homogenizer)
• Bahan semakin halus karena pengecilan ukuran
partikel selama proses, sehingga meningkatkan
luas permukaan bahan dengan cairan penyari
• Penyarian lebih baik dan waktu lebih singkat
dari maserasi
• Cukup beresiko untuk bahan yang termolabil
• Pemisahan antara cairan penyari dengan residu
jauh lebih aktif
• Tidak efektif untuk large scale
ULTRASOUND EXTRACTION
• Penyarian dengan menggunakan gelombang
suara (ultrasonik, frek > 20 Hz)
• Prinsip :
• Dapat menyebabkan rusaknya bahan aktif akibat
oksidasi
• Ekstrak dapat tercemar oleh trace metal
• High energy Cost untuk
penggunaan large scale
Extraction by Electrical Energy
• Penyarian dengan menggunakan tenaga listrik
• Prinsip :
 membuat cavity
menyebarkan tekanan gelombang yang
dihasilkan oleh listrik dg kecepatan ultrasonik
Proses Ekstraksi Seksama/menyeluruh
• Exhaustive extraction : the complete removal of the
desired extractive substance from material
• Perkolatin :
 Plant material is exhaustively extracted by fresh solvent.
 Takes a long time
 Influenced by : selectivity of solvent, quantity flow
(dropping rate) of the solvent, temperatur
• Repercolation :
 First extracted with fresh solvent and then some of
percolate is used for exhaustive exctraction by stagewise
concentration in another percolator
• Continous Countercurrent Extraction
PENGUAPAN/PEMEKATAN EKSTRAK
• Rotary
Evaporator
(pelarut organik,
air  sulit)
• Ekstrak kental
PRINSIP KERJA ROTAVAPORATOR
Penurunan titik didih solven akibat hisapan
pompa vakum, suhu dan adanya pemutaran labu
yang meningkatkan permukaan penguapan.

e.x : Etanol terdestilasi suhu 30 C dengan cepat

SEPARATION
• Why separate compounds ?
 to isolate or consentrate component(s) from a
mixture
To separate a component(s) from other species
that would interfere in the analysis
Methods of Separation
• Extraction
• Crystallization
• Destilation
• Chromatography
Solvent Extraction
• Extraction : transfer of a solute from one phase
to another.
• Can use most any combination of phases (solid,
liquid, gas, supercritical fluid)
• Solvent extraction use two immiscible liquids
(typically aqueus/organic solvent)
• Organic solvents less dense than water (diethyl
ether, toluene, hexane)
• Organic solvents more dense than water
(chloroform, CCl4, dichloromethane)
• Like dissolves like so ideally, the extracting
solvent should be similar to the solute (analyte)
Solvent Extraction
Destilation
Ekstraksi senyawa kandungan menguap (minyak
atsiri) dari bahan (segar atau simplisia) dengan
uap air berdasarkan peristiwa tekanan parsial
senyawa kandungan menguap dengan fase uap air
dari ketel secara kontinu sampai sempurna dan
diakhiri dengan kondensasi fase uap campuran
(senyawa kandungan menguap ikut terdestilasi)
menjadi destilat air bersama senyawa kandungan
yang memisah sempurna atau memisah sebagian.
Alat destilasi
Prinsip Destilasi
• Perbedaan titik didih

• Perbedaan titik uap

KROMATOGRAFI
Tehnik pemisahan fisik campuran komponen
berdasarkan perbedaan migrasi komponen-
komponen tersebut dari fase diam oleh pengaruh
fase gerak
Kromatografi Yang Sering
Digunakan
• Kromatografi Kertas
• Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
• KCKT/HPLC
• KGC
Pemilihan kromatografi didasarkan pada
▫ Sifat kelarutan
▫ Sifat keatsirian
• Kromatografi Kertas
▫ Mudah larut dlm air (KH, asam amino, senyawa
fenolat, asam organik, basa asam nukleat)
• Kromatografi Lapis tipis
 Mudah larut dlm lipid (lipid, steroid, karotenoid,
klorofil)
• GC
▫ Mudah teratsirikan (minyak atsiri, monoterpen,
sesquiterpen, asam lemak)
• KCKT
▫ Sulit teratsirikan
Prinsip : partisi dua fase
• Semakin banyak air  migrasi semakin lambat
• Semakin banyak pelarut organik  migrasi
semakin cepat (Rf tinggi)
Direction of
flow of first
Origin solvent
Separation of
second solvent
is used
Direction
of flow of
second 1st solvent : pelarut organik
solvent
2nd solvent : pelarut air

Separation of first
solvent is used
Kromatografi Kertas
• Eluasi : descending satu arah atau terkadang 2
arah
• Kertas : whatman 46 x 57 cm
• Fase diam : selulosa, alumina, silikat
• Deteksi : bercak berwarna atau berfluoresensi
UV setelah direaksikan
• Fase gerak : Butanol : Asam Asetat : Air
Prosedur Kromatograpy Kertas
• Pemilihan eluen (pelarut pengembang)
Eluasi sampel dengan berbagai eluen
Pilih yg bisa memisahkan senyawa tersebut
• Fraksinasi dengan kromatografi kertas
Ekstrak yg akan ditotolkan berupa garis
Jangan lupa dikeringkan dg hair dryer
Eluasi dg eluen terpilih
Amati noda
Ambil noda yg diinginkan dg memotong kertas
Ekstraksi dg pelarut yg sesuai
Perhitungan harga Rf
Rf = jarak yg ditempuh noda sampel
jarak eluasi

Jarak eluasi
Jarak noda
Contoh : isolasi flavonoid

• Eluen : BAW (Butanol : Asam Asetat : Water)

(4 : 1 : 5 )
• Penampak noda : uap amoniak (kuning intesif)
• Ambil bagian yg kuning  dipotong kecil-kecil
• Ekstraksi
KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS
• Eluasi : Ascending (satu atau dua arah)
• Fase diam : selulosa, silika gel, celite, poliamida,
sephadex
• KLT analitik : tebal 0,1 – 0,25 mm
• KLT preparatif : tebal ad 1 mm
KROMATOGRAFI KOLOM
• Kolom konvesional : eluasi berdasarkan gaya
gravitasi
• Kromatografi cepat : Vacum Liquid
Chromatography
▫ Eluasi dg bantuan pompa
▫ Eluasi bs secara gradien
• Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
▫ Volume injeksi >>> besar
▫ Kolom juga jauh lebih besar dan panjang
▫ Eluat dapat ditampung
Prosedur kromatografi kolom
• Pemilihan Eluen Untuk Fraksinasi
Standar kuukumin dan ekstrak kurkuminoid yg
telah dicuci dilarutkan dlm EtOH 96% dan
ditotolkan 2-5l pd lempeng KLT. Lempeng KLT
selanjutnya dieluasi dg menggunakan eluen yg
sesuai di dlm bak kromatografi sampai batas yg
ditentukan. Amati lempeng pada lampu UV 254 nm
– 365 nm. Eluen dipilih apabila ekstrak
Kurkuminoid yg ditotolkan terpisah menjadi 3 noda
yaitu kurkumin, bisdemetoksi kurkumin, dan
desmetoksi kurkumin.
Perhatikan gambar di bawah ini

Fase I Fase II Fase III

Langkah-langkah untuk fraksinasi dg
kromatografi kolom sbb :
a)Silika gel sebanyak 75x bobot ekstrak kurkuminoid
dimasukkan dlm erlenmeyer dan ditambahkan dg eluen
±2cm diatas permukaan silika gel, dikocok pelan hingga
merata dan dimasukkan hati-hati ke dlm kolom
kromatografi yg pd bagian bawahnya telah diberi glass
wool. Kolom tsb kemudian didiamkan selama 1 hari u/
memampatkan dan melihat ada tidaknya keretakan

a)Apabila kolom tidak retak, tambahkan eluen 0,5 cm

diatas permukaan silika gel dan bila retak ulangi langkah a.
Kemudian kolom ditambahkan ekstrak kurkuminoid (1 %
bobot silika) yg telah dicampur silika gel .
c) Alirkan eluen dan tampung sebanyak ± 50 ml dlm
erlenmeyer (eluen ini blm membawa zat kimia tnman
shg dpt dibuang). Selanjutnya kran dibuka dan diatur
penetesannya (1 tetes/detik) dan ditampung dlm vial
atau tabung yg telah dberi label (@ vial 5ml). Lihat
gmbr dibawah ini.
d) Pada setiap vial dg kelipatan 10 dilakukan uji
KLT u/ melihat noda yg dihasilkan. Apbila
menghasilkan noda yg sama vial-vial tsb
digabung. Penetesan dihentikan bila vial sudah
tidak memberikan noda saat diuji KLT.
Setelah dimurnikan didapatkan  Isolat

(diidentifikasi)
IDENTIFIKASI ISOLAT
• Spektroskopi UV/Vis
• Spektroskopi IR
• Spektroskopi Massa
• Spektroskopi Resonansi Magnetik Nuklir
Sekian…………

Any Questions….??