FITOKIMIA

KROMATOGRAFI

TIM DOSEN FITOKIMIA

UHAMKA
 SENYAWA
TUMBUHAN EKSTRAK ISOLAT
MURNI

PEMISAHAN PEMURNIAN

ELUSIDASI
EKSTRAKSI KROMATOGRAFI STRUKTUR
 TUJUAN
KROMATOGRAFI
Fase diam
(Stationary
phase) Pemisahan

Analisa: kualitatif, kuantitatif

Fase gerak
(Mobile Isolasi/pemurnian
phase)
Parameter penentu kualitas
pemisahan kromatografi

(byknya pelebaran
Efisiensi puncak dari masing-
masing puncak solut)

(tingkat pemisahan
Resolusi puncak-puncak yg
berdekatan)
KROMATOGRAFI
LAPIS TIPIS (KLT)
 FASE DIAM (lanjutan)
Kromatografi sistem fase normal (normal phase)  Silika gel
– Permukaan silika terdiri atas gugus Si-O-Si dan gugus silanol (Si-OH).
– Gugus silanol bersifat sedikit asam dan polar sehingga mampu membentuk
ikatan hidrogen dgn senyawa yg agak polar s/d yg sangat polar.

Natural Product Isolation 2nd edition. 2006.

FASE DIAM (lanjutan)
Kromatografi sistem fase terbalik (reverse phase)  silika
gel termodifikasi

Natural Product Isolation 2nd edition. 2006.

 FASE GERAK (lanjutan)
• Kekuatan pelarut (sebagai fase gerak) dapat diukur pada kondisi polaritas atau
konstanta dielektrik.
• Konstanta dielektrik tinggi  suatu pelarut POLAR (kekuatan untuk mengelusi
besar pada fase diam silika)
• Konstanta dielektrik rendah  suatu pelarut NONPOLAR (kemampuan untuk
mengelusi rendah terhadap fase diam silika)

Natural Product Isolation 2nd edition. 2006.

 Petunjuk dlm memilih dan
mengoptimasi fase gerak:
SISTEM FASE NORMAL
1. Gunakan kloroform:methanol. Awal gunakan kombinasi 8:2, 9:1. Metanol lebih dari 25%
merusak silika gel. Metanol diturunkan jika Rf terlalu besar/bercak terlalu ke atas.
2. Pada pemisahan senyawa yg krg polar, pendahuluan dgn kloroform murni/diklorometan.
3. Sistem lain, dgn menggunkaan n-heksana:etil asetat (7:3, 5:5, 3:7).
4. Utk pemisahan alkaloid, dpt ditambahkan sedikit basa pada fase gerak karena alkaloid basa,
sdgkan silika sedikit asam  afinitas tinggi  tailing.
5. Utk pemisahan senyawa polar (fenolik), gunakan kombinasi kloroform:methanol dgn
penambahan sedikit air atau BAA.
6. Utk mempertajam pemisahan dpt ditambahkan bbrpa tetes/mikroliter asam atau basa lemah.
SISTEM FASE TERBALIK
7. Gunakan kombinasi methanol:asetonitril 1:1, 3:1, 2:1 atau methanol:asetonitril:air 2:2:1, 1:2:1.
(Aziz dkk., 2011)
Natural Product Isolation
2nd edition. 2006.
Cseke L.J., et al. 2006. Natural Product From Plants Ed.2
Teknik KLT
Natural Product Isolation 2nd edition. 2006.
Perhitungan nilai Rf

Natural Product Isolation 2nd edition. 2006.

 SISTEM DETEKSI
SENYAWA PADA KLT
DETEKSI FISIKA (NON DESTRUCTIVE)
• Deteksi dengan Sinar UV
• Keunggulan: nondestruktif, senyawa yang
sudah dideteksi dapat diperoleh dan diamati
kembali melalui proses pemisahan lanjutan.
• Kelemahan: senyawa yang tidak menyerap
sinar UV 254 dan 366 nm tidak tampak dan
memerlukan deteksi lanjutkan dengan
pereaksi semprot.
DETEKSI KIMIA (DESTRUCTIVE)
• Deteksi dengan Pereaksi deteksi
• Terkadang pemanasan diperlukan untuk
memperkuat warna yg dideteksi (dgn oven
atau hair dryer).
• Keunggulan: dapat mendeteksi golongan
senyawa spesifik dengan pereaksi spesifik
• Kelemahan: senyawa yang telah dideteksi
tidak dapat diperoleh kembali.
Natural Product Isolation 2nd edition. 2006.
lanjutan

Natural Product Isolation 2nd edition. 2006.

 Metode Analisa Metode KLT
Kuantitatif KLT Preparatif
a. KLT-Densitometri – Untuk metode isolasi (pemurnian)
– Dilakukan pada lapisan yang agak tebal
b. KLT-Spektrofotometri
(0,5-2 mm).
– Sampel ditotolkan pada lempeng 
  dikembangkan  dideteksi dengan cara
non-destruktif  bercak yang
mengandung analit yang dikehendaki 
dikerok dan disaring dengan pelarut
tertentu.

PTLC is nearly always used as a final purification step in an isolation procedure

KROMATOGRAFI
KOLOM
Rangkaian alat kromatografi kolom
COLUMN 1. METODE KERING

PACKING kolom diisi dengan fase diam kering, diikuti

dengan penambahan fase gerak ke dalam pada
METHODS kolom sampai benar-benar basah.

- Isi kolom dengan fase diam

-Isi kolom dengan pelarut non polar - tambahkan pelarut non polar, perlahan
- Ditambahkan fase diam, perlahan - cocok untuk alumina sbg fase diam
COLUMN
PACKING
METHODS
(lanjutan)
2. METODE BASAH
– Prosedur diawali dengan
pembuatan bubur yang terdiri
dari campuran eluen pada
serbuk fase diam.
– Bubur dimasukkan secara
hati-hati pada kolom 
supaya tidak ada gelembung
udara.
COLUMN PACKING
METHODS (lanjutan)

– Setelah kolom selesai dikemas, jangan

biarkan kolom kering  agar tidak
terbentuk gelembung udara, patahan
pada kolom, dan bentuk kolom tidak
rata yang mengakibatkan pemisahan
komponen tidak baik (buruk).
 SAMPLE LOADING
METHODS

A. METODE KERING
sampel  dilarutkan dengan sedikit pelarut  tambahkan sejumlah
bubuk silika kering (cukup untuk membentuk pita sepanjang 1-3 cm
pada kolom)  campurkan hingga pelarut menguap dan hanya tersisa
bubuk kering yang telah mengandung bahan uji  masukkan ke
dalam kolom yang sudah dipacking  tambahkan eluen  mulai elusi
 SAMPLE LOADING
METHODS (lanjutan)

B. METODE BASAH
sampel  dilarutkan dengan sedikit pelarut  dimasukkan
menggunakan pipet ke dalam kolom yang telah dipacking 
tambahkan eluen  mulai elusi
Hasil pemisahan KK dipengaruhi oleh :
- Pemilihan fase diam dan fase gerak
- Pemilihan metode packing kolom
- Laju aliran
- Panjang/tinggi kolom
High
Performance
Liquid
Chromatogra
phy
(HPLC)
Keunggulan HPLC
• otomatis
• Resolusi tinggi
• cepat dan efisien
• Reproduksibilitas sangat baik
• Preparasi sederhana
Kelemahan HPLC
• relatif mahal
• Masa kerja pendek (berkaitan
dengan umur kolom)
• Pada laju alir yang tinggi
dibutuhkan biaya yang besar untuk
pembelian dan pembuangan pelarut
berkemurnian tinggi.
 Contoh
kromatogram HPLC

Pemisahan berdasarkan waktu retensi

Kuantitas berdasarkan luas area

WAKTU RETENSI

Prajogo, 2015
Prajogo, 2015
GC
Keunggulan GC
• efisiensi pemisahan yang
tinggi
• analisis relatif cepat dan
sensitifitasnya tinggi
Kelemahan GC
• terbatas untuk zat yang
mudah menguap
• tidak mudah dipakai untuk
memisahkan campuran
dalam jumlah besar
• Relatif mahal
Analisa Komponen

– Untuk analisa kualitatif  komponen-komponen

yang terelusi dikenali dari nilai waktu retensi (TR)
tiap puncak pada kromatogram. TR analit
dibandingkan dengan TR standar pada kondisi
operasi alat yang sama.
– Untuk analisa kuantitatif  penentuan kadar
atau jumlah analit dilakukan dengan
membandingkan luas puncak analit dengan luas
puncak standar.
Contoh hasil kromatogram KG
KELIMPAHAN

WAKTU RETENSI

KROMATOGRAM KOMPONEN MINYAK ATSIRI DAUN KEMANGI (Nurkamalia, 2017)

Chromatotron 
(Centrifugal Thin-
Layer
Chromatography)
Countercurrent
chromatography
(CCC)
PRINSIP KERJA
– Countercurrent chromatography (CCC) adalah kromatografi
pemisahan yang merupakan teknik kromatografi cair-cair
– Pemisahan komponen dalam campuran berdasarkan
perbedaan afinitas dari fase gerak dan fase diam
– Fase diam dan fase gerak semuanya merupakan cairan.
Partisi dua zat terlarut pada dua fase didasarkan pada
perbedaan factor kapasitas, k dan koefisient distribusi (kd)
pada fase diam dan fase gerak
KEUNTUNGAN KERUGIAN

Banyak keuntungan yang didapatkan – Butuh waktu lama untuk

Karena CCC tidak menggunakan fasa menentukan pelarut yang tepat
padat sebagai fasa diam , yaitu :
– Perubahan komposisi dari salah
– Mencegah sampel yang hilang
satu fase akan merubah fase yang
pada saat proses adsorpsi pada lain yang akan merubah gradien
fasa diam
elusi
– Mencegah denaturasi
– Mencegah proses tailing
– Mencegah kontaminas
SISTEM PELARUT

Faktor-faktor yang harus diperhatikan dalam memilih sistem

pelarut;
– Kelarutan sampel dalam sistem pelarut,
– Stabilitas sampel dalam sistem pelarut, waktu
– Settling/pengendapan dari sistem pelarut,
– Koefisien partisi sampel,
– Retensi yang memuaskan fase diam dalam kolom
SISTEM PELARUT

Baik air ataupun pelarut organik dari sistem cair dua fasa
dapat digunakan sebagai fasa gerak. kriteria yang harus
dimiliki adalah :
1. Pelarut yang digunakan harus membentuk dua fasa yang
tidak bercampur
2. Harus tahan dengan kondisi kolom CCC
3. Sampel harus dapat terpisah pada sistem cair dua fasa
yang dipilih
TERIMAKASIH