FITOKIMIA

KROMATOGRAFI

TIM DOSEN FITOKIMIA

UHAMKA
 Dua fase penting
dalam kromatografi :

Fase diam Fase gerak

(Stationary (Mobile
phase) phase)
 PRINSIP
KROMATOGRAFI
– Perbedaan daya adsorbsi atau kelarutan
solut.
– Kecepatan migrasi dari tiap komponen
solut berbeda-beda  komponen-
komponen akan terpisah satu dengan
yang lain.
Adsorpsi Partisi

Mekanisme
pemisahan
kromatografi

Pertukaran
Ekslusi ion
 Parameter penentu kualitas
pemisahan kromatografi

• (byknya
Efisiensi pelebaran puncak
dari masing-masing
puncak solut)

• (tingkat
Resolusi pemisahan puncak-
puncak yg
berdekatan)
 TUJUAN
KROMATOGRAFI

Pemisahan

Analisa: kualitatif, kuantitatif

Isolasi/pemurnian
 Tujuan analisis kualitatif

• membandingkan nilai Rf (KKt, KLT)

ada tidaknya senyawa tertentu • Membandingkan waktu retensi (HPLC, GC)
(kecuali kromatografi kolom) • Membandingkan volume retensi (Kromatografi
ukuran eksklusi)

• Jumlah bercak (KLT dan KKt) dan jumlah

Informasi kerumitan suatu
puncak (KCKT) menunjukkan adanya jumlah
campuran
minimum komponen dalam campuran.

Menetapkan pola sidik jari

Memantau cara/tahapan selama

proses ekstraksi dan pemisahan
Kelebihan metode kromatografi
untuk tujuan analisa kualitatif:

Jumlah sampel yang dibutuhkan sedikit

Dapat untuk mengkromatografi

beberapa cuplikan sekaligus (KKt, KLT)

Daya pisah tinggi

Waktu yang dibutuhkan untuk analisis

sedikit (dengan catatan jika kondisi
sudah diketahui)
Tujuan analisis kuantitatif
Menetapkan kadar senyawa pada
sampel

Menetapkan jumlah komponen

relatif (metode tinggi puncak dan
metode luas puncak)

Menetapkan kuantitatif mutlak, jika

ada standar atau kalibrasi yang
sesuai.
 Tujuan preparatif

Memperoleh komponen
campuran dalam jumlah yang
memadai (mg-gram) dalam
keadaaan murni.
• Metode terpilih : KLT preparatif
(sederhana, murah tetapi kapasitas
pemisahan terbatas), Kromatografi kolom
Pembagian Kromatografi

Kromatografi
adsorbsi

Kromatografi
eksklusi Kromatografi
ukuran partisi
Berdasarkan
mekanisme
pemisahannya

Kromatografi Kromatografi
penukar ion pasangan ion
Pembagian Kromatografi

Kromatografi
Kertas (KKt)

Kromatografi Berdasarkan Kromatografi

Gas alat yang Lapis Tipis
(KG/GC) digunakan (KLT)

Kromatografi
Cair
Pembagian Kromatografi
Kromatografi
cair-padat

Elektroforesis Kromatografi
cair-cair

Berdasarkan
Kromatografi jenis, fase dan
eksklusi Kromatografi
ukuran/kromat mekanisme gas-padat
ografi gel distribusi pada
fase

Kromatografi Kromatografi
penukar ion gas-cair

Kromatografi
planar
KROMATOGRAFI
LAPIS TIPIS
(KLT)
 Keuntungan

peralatan sedikit
murah
sederhana

waktu analisis cepat

daya pisah cukup baik
cocok untuk pemisahan (isolasi)
cocok untuk identifikasi (kualitatif dan kuantitatif)
senyawa bahan alam
 TUJUAN
MELAKUKAN KLT
– Menentukan banyaknya komponen dalam
campuran
– Identifikasi senyawa
– Menentukan efektifitas pemurnian
senyawa
– Menentukan kondisi yang sesuai untuk
kromatografi kolom
 PRINSIP
PELAKSANAAN KLT

Mekanisme pemisahan KLT

adsorpsi partisi

Fase gerak
Fase gerak Komponen-
membawa
bergerak komponen yang
komponen-
disepanjang fase berbeda akan Terjadi pemisahan
komponen yang
diam (oleh gaya bergerak pada laju
terdapat dalam
kapilaritas) yang berbeda
campuran
FASE DIAM
– Berupa lapisan yang seragam pada permukaan bidang
datar yang didukung oleh lempeng kaca, plat aluminium,
atau plat plastik.
– Fase diam yg paling sering digunakan adalah silika gel, silika
gel yg dimodifikasi dgn hidrokarbon, selulosa, alumina.
– Fase diam berdiameter partikel antara 10-30 µm.
– Fase diam utk KLT seringkali juga mengandung substansi
yang mana dapat ber-flouresensi (berpendar) di bawah
sinar ultra violet (UV) seperti seng silikat teraktivasi
mangan.
– Pada plat KLT juga ada yg sudah ditambahkan agen
pengikat seperti gypsum (CaCO4.1/2H2O).
FASE DIAM (lanjutan)
– Indikator UV254  silikat zink teraktivasi mangan
di bawah sinar UV 254 nm (panjang gelombang rendah) 
plat berwarna hijau pucat
di bawah sinar UV 366 nm (panjang gelombang yang lebih
tinggi)  plat berwarna gelap
senyawa yang menyerap cahaya pada panjang gelombang
254 dan 366 akan terlihat sebagai bercak dikarenakan
memiliki ikatan rangkap (C=C) terkonjugasi.
 FASE DIAM (lanjutan)
Kromatografi sistem fase normal (normal phase)  Silika gel
– Permukaan silika terdiri atas gugus Si-O-Si dan gugus silanol (Si-
OH).
– Gugus silanol bersifat sedikit asam dan polar sehingga mampu
membentuk ikatan hidrogen dgn senyawa yg agak polar s/d yg
sangat polar.
– Polaritas terkait dengan tipe dan jumlah gugus fungsional pada
molekul yang mampu membentuk ikatan hidrogen.
– Gugus fungsi non-polar : CH3-, CH3O-, Ph-, CH3CH2
– Gugus fungsi polar: -COOH, -OH, -NH2, SO3H, PO3H2.
 Silika gel

Natural Product Isolation 2nd edition. 2006.

FASE DIAM (lanjutan)
Kromatografi sistem fase terbalik (reverse
phase)  silika gel termodifikasi

Natural Product Isolation 2nd edition. 2006.

FASE GERAK
– Fase gerak  pelarut atau campuran
pelarut (biasanya 2 pelarut organik) yang
sesuai.
– Fase gerak bisa dipilih dari pustaka atau
coba-coba.
– Kemurnian pelarut harus sangat tinggi
– Daya elusi harus diatur agar nilai Rf
berkisar 0,2-0,8 agar pemisahan maksimal.
 FASE GERAK (lanjutan)
• Kekuatan pelarut (sebagai fase gerak) dapat diukur pada kondisi polaritas atau
konstanta dielektrik.
• Konstanta dielektrik tinggi  suatu pelarut POLAR (kekuatan untuk mengelusi
besar pada fase diam silika)
• Konstanta dielektrik rendah  suatu pelarut NONPOLAR (kemampuan untuk
mengelusi rendah terhadap fase diam silika)

Natural Product Isolation 2nd edition. 2006.

 Petunjuk dlm memilih dan
mengoptimasi fase gerak:
SISTEM FASE NORMAL
1. Gunakan kloroform:methanol. Awal gunakan kombinasi 8:2, 9:1. Metanol lebih dari 25%
merusak silika gel. Metanol diturunkan jika Rf terlalu besar/bercak terlalu ke atas.
2. Pada pemisahan senyawa yg krg polar, pendahuluan dgn kloroform murni/diklorometan.
3. Sistem lain, dgn menggunkaan n-heksana:etil asetat (7:3, 5:5, 3:7).
4. Utk pemisahan alkaloid, dpt ditambahkan sedikit basa pada fase gerak karena alkaloid basa,
sdgkan silika sedikit asam  afinitas tinggi  tailing.
5. Utk pemisahan senyawa polar (fenolik), gunakan kombinasi kloroform:methanol dgn
penambahan sedikit air atau BAA.
6. Utk mempertajam pemisahan dpt ditambahkan bbrpa tetes/mikroliter asam atau basa lemah.
SISTEM FASE TERBALIK
1. Gunakan kombinasi methanol:asetonitril 1:1, 3:1, 2:1 atau methanol:asetonitril:air 2:2:1, 1:2:1.
(Aziz dkk., 2011)
Natural Product Isolation
2nd edition. 2006.
Cseke L.J., et al. 2006. Natural Product From Plants Ed.2
 PREPARASI PROSEDUR
KLT

– Plat dapat dipotong sesuai ukuran yg

diperlukan dengan menggunakan gunting
secara hati-hati.
– Air pada atmosfer dpt diserap oleh permukaan
silika gel  sisi aktif silika menjadi tidak aktif.
Sblm digunakan silika gel perlu diaktivasi
terlebih dahulu dgn cara memanaskannya pada
suhu 120C selama 30-60 menit dalam oven.

Waksmundzka-Hajnos et al., 2008. Thin layer chromatography in phytochemistry vol.99

Teknik KLT
1. Gambar garis menggunakan pensilpada bagian bawah dan atas plat.
2. Penandaan garis pada bagian bawah plat untuk menunjukkan posisi awal
dari totolan; sedangkan pada bagian atas plat untuk menunjukkan batas
akhir perjalanan fase gerak.
3. Larutan sampel (dalam jumlah µL; paling sedikit 0,5 µL atau 2-10 µL)
ditotolkan (secara manual/otomatis) pada plat menggunakan tube
mikrokapiler dengan bentuk bercak bulat (spot) atau pita memanjang
(band).
4. Ketika tempat penotolan pada plat mengering, plat ditempatkan dalam
sebuah chamber bertutup berisi fase gerak yang telah dijenuhkan dalam
jumlah yang tidak terlalu banyak (tinggi fase gerak dlm chamber harus
lebih rendah dari tempat penotolan). Tutup kembali chamber.
5. Biarkan fase gerak bergerak bersama senyawa yang dipisahkan di antara
fase diam (disebut proses elusi) sampai dengan garis batas bagian atas
plat.
6. Keluarkan plat, dan biarkan kering di udara.
7. Lakukan metode deteksi senyawa secara fisika dan kimia.
8. Hitung nilai Rf.
Natural Product Isolation 2nd edition. 2006.
Perhitungan nilai Rf

Natural Product Isolation 2nd edition. 2006.

Pada kromatografi adsorpsi, (fase diam yang digunakan adalah silika gel), maka:
– jika senyawa yang dianalisis bersifat polar  senyawa tsb akan memiliki
afinitas yang tinggi terhadap fase diam  tertahan pada fase diam  lambat
bermigrasi/berpindah pada plat bersama fase gerak. Senyawa ini akan
memiliki nilai Rf yang relatif kecil.
– Jika senyawa yang dianalisis bersifat nonpolar  senyawa tsb akan memiliki
afinitas yang kecil terhadap fase diam  berpindah cepat pada plat bersama
dengan fase gerak. Senyawa ini akan memiliki nilai Rf yang relatif besar.

Senyawa Senyawa
Non polar Polar

Natural Product Isolation 2nd edition. 2006.

 SISTEM DETEKSI
SENYAWA PADA KLT
DETEKSI FISIKA (NON DESTRUCTIVE)
• Deteksi dengan Sinar UV
• Keunggulan: nondestruktif, senyawa yang
sudah dideteksi dapat diperoleh dan
diamati kembali melalui proses pemisahan
lanjutan.
• Kelemahan: senyawa yang tidak menyerap
sinar UV 254 dan 366 nm tidak tampak dan
memerlukan deteksi lanjutkan dengan
pereaksi semprot.
DETEKSI KIMIA (DESTRUCTIVE)
• Deteksi dengan Pereaksi deteksi
• Terkadang pemanasan diperlukan untuk
memperkuat warna yg dideteksi (dgn oven
atau hair dryer).
• Keunggulan: dapat mendeteksi golongan
senyawa spesifik dengan pereaksi spesifik
• Kelemahan: senyawa yang telah dideteksi
tidak dapat diperoleh kembali.
Natural Product Isolation 2nd edition. 2006.
 Proses elusi

Perhatian :
Perlu hati-hati pada mata dan kulit
UV light is MUTAGENIC !
lanjutan

Natural Product Isolation 2nd edition. 2006.

 Metode Analisa
Kuantitatif KLT
a. KLT-Densitometri
- Bekerja berdasarkan serapan atau fluoresensi
- Kurva baku dibuat untuk setiap plat dan kadar
dihitung seperti pada metode spektrofotometri.
b. KLT-Spektrofotometri
Bercak pada plat dikerok, disari dengan pelarut
polar (etanol), disaring, dan dilanjutkan
pengukuran secara spektrofotometri.
 Metode KLT
Preparatif
– Untuk metode isolasi (pemurnian)
– Dilakukan pada lapisan yang agak tebal (0,5-2
mm).
– Sampel ditotolkan pada lempeng 
dikembangkan  dideteksi dengan cara non-
destruktif  bercak yang mengandung analit
yang dikehendaki  dikerok dan disaring
dengan pelarut tertentu.
 Kapan menggunakan KLT
preparatif?

PTLC is nearly always used as a final purification step in an isolation procedure

Natural Product Isolation 2nd edition. 2006.

 Metode KLT Preparatif
(lanjutan)

KEUNGGULAN:
– Relatif murah dibanding HPLC, CCC
– Sederhana
– Dapat mengisolasi senyawa bahan alam dgn cepat pada kadar mg s/d
g.
– Pelarut dan fase diam yg digunakan fleksibel.
– Dapat memisahkan sejumlah sampel sekaligus.
KELEMAHAN:
– Kurang baik pada proses deteksi dan kontrol elusi dibanding HPLC
– Muatan dan kecepatan analisis tidak sebaik VLC
KROMATOGRAFI
KOLOM
Kromatografi Kolom
– Kromatografi kolom adalah salah satu metode
yang digunakan untuk pemisahan senyawa dari
campuran dengan menggunakan kolom.
– Alat utama yang digunakan adalah sebuah
tabung kaca dengan ukuran diameter terhadap
panjang kolom dalam rentang 1:10 sampai 1:30
(diameter = 5-50 mm dan panjang = 5 cm - 1 m).
– Pada bagian dasar tabung diberi semacam
penyaring dari kapas atau glass wool untuk
menghindari hilangnya fase diam.
Rangkaian alat kromatografi kolom
FASE GERAK
– Fase gerak atau eluen adalah campuran cairan murni.
– Eluen dipilih sedemikian rupa sehingga faktor retensi
senyawa berkisar antara 0,2-0,3 supaya meminimalisasi
penggunaan waktu dan jumlah eluen melewati kolom.
– Jenis eluen yang digunakan pada kromatografi kolom dipilih
supaya senyawa yang berbeda dapat dipisahkan secara
efektif.
– Eluen yang digunakan dapat dicoba terlebih dahulu
menggunakan KLT. Setelah cocok, eluen yang sama
digunakan untuk mengelusi komponen dalam kolom.
– Dapat menggunakan sistem gradien atau isokratik
FASE DIAM
– Biasanya digunakan silika gel atau alumina.
– Fase diam berbentuk serbuk microporous untuk
meningkatkan luas permukaan.
– Ukuran partikel fase diam sangatlah penting, karena jika
ukuran partikel terlalu kecil, laju aliran eluen mungkin akan
terlalu lambat, sedangkan jika terlalu besar maka pemisahan
komponen menjadi tidak baik.
– Ukuran partikel fase diam yang digunakan biasanya pada
rentang 100-300 mesh.
– Fase diam haruslah seragam, inert, tidak tercemar zat
pengotor, dan cukup aktif sehingga memungkinkan
perambatan zat uji.
TEKNIK KROMATOGRAFI KOLOM

– Persiapan kolom : menyumbat leher

kolom dengan kapas/glass wool untuk
mencegah hilangnya fase diam di dalam
kolom selama proses elusi.
– Pengisian kolom (column packing)
– Pemasukan sampel (sample loading)
– Elusi
COLUMN PACKING
METHODS

1. METODE KERING
kolom diisi dengan fase diam
kering, diikuti dengan penambahan
fase gerak ke dalam pada kolom
sampai benar-benar basah.
-Isi kolom dengan pelarut non polar - Isi kolom dengan fase diam
- Ditambahkan fase diam, perlahan - tambahkan pelarut non polar, perlahan
- cocok untuk alumina sbg fase diam
COLUMN PACKING
METHODS (lanjutan)

2. METODE BASAH
– Prosedur diawali dengan pembuatan bubur
yang terdiri dari campuran eluen pada
serbuk fase diam.
– Bubur dimasukkan secara hati-hati pada
kolom. Dalam langkah ini harus benar-benar
hati-hati supaya tidak ada gelembung udara.
COLUMN PACKING
METHODS (lanjutan)

– Setelah kolom selesai dikemas, jangan

biarkan kolom kering karena hal ini
dapat menyebabkan terbentuknya
gelembung udara, patahan pada
kolom, dan bentuk kolom tidak rata
yang mengakibatkan pemisahan
komponen tidak baik (buruk).
 SAMPLE LOADING
METHODS

A. METODE KERING
sampel  dilarutkan dengan sedikit pelarut  tambahkan sejumlah
bubuk silika kering (cukup untuk membentuk pita sepanjang 1-3 cm
pada kolom)  campurkan hingga pelarut menguap dan hanya tersisa
bubuk kering yang telah mengandung bahan uji  masukkan ke dalam
kolom yang sudah dipacking  tambahkan eluen  mulai elusi
 SAMPLE LOADING
METHODS (lanjutan)
B. METODE BASAH
sampel  dilarutkan dengan sedikit pelarut 
dimasukkan menggunakan pipet ke dalam kolom yang
telah dipacking  tambahkan eluen  mulai elusi
 PROSES ELUSI

– Komponen senyawa ditahan pada fase diam (berupa adorben) karena telah
terikat.
– Ketika eluen dialirkan ke dalam kolom, maka senyawa akan melakukan migrasi
(bergerak turun melalui kolom), terbawa oleh eluen sesuai dengan kepolaran.
– Masing-masing senyawa mempunyai kecepatan yang berbeda-beda dalam
melewati kolom  terjadi pemisahan  terbentuk pita-pita (zona) berwarna 
akan didapatkan beberapa fraksi yang akan ditampung di wadah.
– Masing-masing fraksi kemungkinan mengandung senyawa yang berbeda (1-2
komponen senyawa)
– Untuk mengujinya, fraksi hasil kromatografi kolom dapat diamati menggunakan
KLT.
– Fraksi dengan Rf yang mirip, kemungkinan mengandung senyawa yang sama.
Bagaimana jika senyawa
tidak berwarna?

– Untuk senyawa tidak berwarna pada

kolom, maka dapat diatasi dengan
penambahan pereaksi kimia (contoh:
fosfor anorganik ke dalam fase diam)
 selama proses elusi kolom disinari
UV  terjadi pendaran sehingga
pemisahan mudah dipantau.
Hasil pemisahan KK dipengaruhi oleh :
- Pemilihan fase diam dan fase gerak
- Pemilihan metode packing kolom
- Laju aliran
- Panjang/tinggi kolom
HPLC
– HPLC  High Performance Liquid
Chromatography
– Prinsip  pemisahan setiap komponen
dalam sampel (analit) berdasarkan
kepolarannya.
– Identifikasi kualitatif dan kuantitatif.
– Analisis senyawa tidak menguap (non-
volatile)
Keunggulan HPLC Kelemahan HPLC
• otomatis • relatif mahal
• Resolusi tinggi • Masa kerja pendek
• cepat dan efisien (berkaitan dengan umur
• Reproduksibilitas sangat kolom)
baik • Pada laju alir yang tinggi
• Preparasi sederhana dibutuhkan biaya yang
besar untuk pembelian dan
pembuangan pelarut
berkemurnian tinggi.
AnFar-
2007

62
FASE GERAK
HPLC Mobile Phase criteria :
– High solubility for the sample
components
– Non corrosive to HPLC system
components
– High purity, low cost, UV transparency
– Others: low viscosity, low toxicity, non
flammability
FASE GERAK
Fase gerak dijalankan dengan 2 teknik:
– elusi gradien, yaitu konsentrasi pelarut
tertentu ditingkatkan selama periode
waktu tertentu, misalnya : pemisahan
dimulai dengan 100% air dan meningkat
menjadi 100% asetonitril dalam waktu 30
menit.
– elusi isokratik, yaitu menggunakan
komposisi pelarut yang tetap, misalnya:
70% asetonitril dalam air.
KOLOM

– Kolom merupakan bagian HPLC

yang mana terdapat fase diam untuk
berlangsungnya proses pemisahan
solut/analit.
– Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu
kolom konvensional dan kolom
mikrobor.
SISTEM HPLC
– HPLC fase terbalik, fase diamnya adalah C18
atau C8). Fase gerak yang paling sering
digunakan adalah campuran larutan buffer-
metanol, campuran air-metanol, atau
campuran air-asetonitril.
– HPLC fase normal, fase diamnya adalah
silika. Fase gerak yang paling sering
digunakan adalah campuran pelarut-pelarut
hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi
atau menggunakan pelarut-pelarut jenis
alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini
kurang umum dibanding dengan fase terbalik
POMPA
– Pompa yang digunakan sebaiknya mampu
memberikan tekanan sampai 5000 psi dan
mampu mengalirkan fase gerak dengan
kecepatan alir 3 mL/menit.
– Untuk tujuan preparatif, pompa yang
digunakan harus mampu mengalirkan fase
gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.
DETEKTOR

• mampu mendeteksi zat secara

umum
UNIVERSAL • seperti detektor indeks bias
dan detektor spektrometri
massa

• mendeteksi analit secara

spesifik dan selektif
SPESIFIK • seperti detektor UV-Vis,
detektor fluoresensi.
 Contoh
kromatogram
HPLC

Prajogo, 2015
Prajogo, 2015
GC
– Pemisahan dan deteksi senyawa
organik yang mudah menguap
dalam suatu campuran
– Kromatografi gas  fase
bergeraknya adalah gas dan
zat terlarut terpisah sebagai uap.
Syarat bahan uji

– Sampel harus mudah menguap dan

stabil pada temperatur pengujian,
utamanya dari 50 – 300°C
– Senyawa yang tidak mudah
menguap atau tidak stabil pada
temperatur pengujian 
diderivatisasi menjadi komponen
yang volatil
Jenis KG

– Kromatografi gas–cair (KGC)

yang fase diamnya berupa cairan
yang diikatkan pada suatu
pendukung sehingga solut akan
terlarut dalam fase diam.
– Kromatografi gas-padat
(KGP), yang fase diamnya
berupa padatan dan kadang-
kadang berupa polimerik.
Keunggulan GC Kelemahan GC
•efisiensi pemisahan •terbatas untuk zat
yang tinggi yang mudah menguap
•analisis relatif cepat •tidak mudah dipakai
dan sensitifitasnya untuk memisahkan
tinggi campuran dalam
jumlah besar
•Relatif mahal
FASE GERAK  gas pembawa

Syarat gas pembawa:

– tidak reaktif;
– murni/kering karena kalau tidak
murni akan berpengaruh pada
detektor;
– dapat disimpan dalam tangki
tekanan tinggi (biasanya merah
untuk hidrogen, dan abu-abu untuk
nitrogen)
KOLOM

– Kolom merupakan tempat terjadinya

proses pemisahan karena di
dalamnya terdapat fase diam.
– Ada 3 jenis kolom pada GC:
1. kolom kemas (packing column)
2. kolom kapiler (capillary column);
3. kolom preparative (preparative
column).
FASE DIAM

– Fase diam non polar yang paling

banyak digunakan adalah metil
polisiloksan dan fenil 5%-
metilpolisiloksan 95%
– Fase diam semi polar adalah seperti
fenil 50%-metilpolisiloksan 50%,
– Fase diam yang polar adalah seperti
polietilen glikol
Proses pemisahan pada GC

– Sampel disuntikkan ke dalam kolom.

– Komponen-komponen di dalam kolom diuapkan
– Uap komponen dielusi oleh gas pembawa untuk melalui kolom.
– Perbedaan laju migrasi masing-masing komponen dalam kolom
disebabkan oleh perbedaan titik didih dan interaksi masing-masing
komponen dengan fasa stasioner.
– Pendeteksian saat keluar dari kolom dilakukan berdasarkan
perubahan sifat fisika aliran gas yang disebabkan adanya komponen
yang dikandungnya.
– Sifat fisika tersebut, misalnya daya hantar panas, absorpsi radiasi
elektromagnetik, indeks refraksi, derajat terinduksi ion, dsb.
Analisa Komponen

– Untuk analisa kualitatif  komponen-komponen

yang terelusi dikenali dari nilai waktu retensi (TR).
TR analit dibandingkan dengan TR standar pada
kondisi operasi alat yang sama.
– Untuk analisa kuantitatif  penentuan kadar
atau jumlah analit dilakukan dengan
membandingkan luas puncak analit dengan luas
puncak standar.
Interpretasi hasil

– Penafsiran hasil dari GC ditentukan melalui waktu

retensi (yaitu: waktu yang digunakan oleh senyawa
tertentu untuk bergerak melalui kolom sampai ke
detektor)
– Setiap senyawa memiliki waktu retensi yang
berbeda bergantung pada titik didih senyawa,
kelarutan dalam fase diam, dan temperatur kolom.
– Waktu retensi ini akan kemudian menjadi puncak
atau peak pada kromatogram.
– Kromatogram terdiri dari aksis  waktu dan
ordinat  kelimpahan
Contoh hasil kromatogram
KG
KROMATOGRAM KOMPONEN MINYAK ATSIRI DAUN KEMANGI (Nurkamalia, 2017)
Chromatotron
(Centrifugal Thin-
Layer
Chromatography)
– KROMATOTRON adalah KLT preparative yang
dipercepat dengan sentrifugasi radial.
– Prinsip kerja: larutan sampel ditotolkan pada titik
tengah cakram yang berputar di mana telah dilapisi
fase diam. Elusi oleh fase gerak membentuk pita
lingkaran. Eluat akan bergerak ke titik luar putaran dan
kemudian dapat ditampung pada tube.
– Capacity: Up to 500 mg per component
Special Advantages:

– No “spotting” of samples or scraping of bands.

– Separations are completed rapidly, typically within 20 min.
– A UV transparent lid allows direct observation of UV absorbing
or colored compounds during the separation.
– Layer thickness of 1, 2, 4 or 8 mm gives high capacity. The
sorbent layer is easily regenerated in situ for reuse.
– Solvents are used sparingly. Gradient elution is easy. A
nitrogen atmosphere prevents oxidation of samples.
– Compact (easily moved from lab to lab), few controls, no high
pressures.
– Low price. Half a dozen Chromatotrons cost less than a single
prep HPLC.
FASE GERAK

– The mobile phase elutes continuously into a specially

shaped collection channel inside the body of the
instrument. Component bands are collected manually in
test tubes or optionally by an automated fraction collector.
– Solvents: Compatible with all common chromatography
solvents, including acetic acid. Not suitable for use with
mineral acids.
– Separations occur quickly, usually within 20 minutes, versus
the typical 90 to 120 minutes for preparative Thin Layer
Chromatography (TLC) or Column Chromatography.
FASE DIAM
– The stationary phase for the cyclograph instrument is
called a rotor. A rotor is similar to a preparative TLC plate
but it is round instead of rectangular.
– Silica gel, alumina and silica gel – silver nitrate. Not useful
with RP sorbents.
– The motor will spin the rotor at 720 RPM
CARA KERJA
– Rotor dipasang dan diatur berputar menggunakan motor pada
kecepatan 720 RPM.
– Sampel dalam bentuk larutan dimasukkan melalui syringe
menggunakan pompa pelarut. Pita akan berbentuk lingkaran
pada rotor.
– Fase gerak kemudian dimasukkan pada titik tengah putaran
melalui syringe menggunakan pompa pelarut untuk
melakukan elusi.
– Komponen senyawa akan bermigrasi ke titik luar putaran
melalui rotor membentuk lingkaran dgn affinitas yang berbeda
antara fase diam dan fase geraknya  terjadi pemisahan
– Tiap pita berwarna yang terpisah ditampung dan dikumpulkan
untuk analisis lebih lanjut.
Countercurrent
chromatography
(CCC)
PREFACE
– Countercurrent chromatography (CCC) is a liquid
chromatography (LC) technique that uses two immiscible
liquid phases without any solid support
– The inventor of the technique, Yoichiro Ito, named it after
the countercurrent partition method of Craig that also used
partitioning between two liquid phases to separate solutes
PRINSIP KERJA
– Countercurrent chromatography (CCC) adalah kromatografi
pemisahan yang merupakan teknik kromatografi cair-cair
– Pemisahan komponen dalam campuran berdasarkan
perbedaan afinitas dari fase gerak dan fase diam
– Fase diam dan fase gerak semuanya merupakan cairan.
Partisi dua zat terlarut pada dua fase didasarkan pada
perbedaan factor kapasitas, k dan koefisient distribusi (kd)
pada fase diam dan fase gerak
KEUNTUNGAN
Banyak keuntungan yang didapatkan Karena CCC tidak
menggunakan fasa padat sebagai fasa diam , yaitu :
– Mencegah sampel yang hilang pada saat proses adsorpsi
pada fasa diam
– Mencegah denaturasi
– Mencegah proses tailing
– Mencegah kontaminas
KERUGIAN
– Butuh waktu lama untuk menentukan pelarut yang tepat
– Perubahan komposisi dari salah satu fase akan merubah
fase yang lain yang akan merubah gradien elusi
PEMBAGIAN CCC
CCC dikembangkan menjadi dua sistem
1. Sistem hidrostatis
2. Sistem hidrodinamik
SISTEM HIDROSTATIS

– Sistem hidrostatis menggunakan kumparan

– Pertama kumparan diisi dengan fasa diam (baik
yang ringan (BJ) atau yang lebih berat dari
sistem pelarut dua fasa yang disetimbangkan)
dan fasa gerak masuk melalui bagian ujung
tabung
– Fasa gerak akan merembes melalui segmen fasa
diam di satu sisi tabung
– Proses ini terjadi secara kontinu hingga fasa
gerak mencapai bagian ujung yang lain dari
kumparan
– Solut (sampel) pada bagian dalam akan
berpartisi diantara dua fasa pada masing-
masing kumpaaran dan terpisah bergantung
pada koefisien partisinya
SISTEM HIDROSTATIS
– Sistem kolom hidrostatis awalnya
menggunakan gravitasi untuk
menjaga fasa diam cairnya; sistem
ini disebut Droplet Counter Current
Chromatography (DCCC)
– Tehnik ini memerlukan waktu yang
lama untuk proses elusinya
– Metode ini sudah lama tidak
digunakan lagi sekarang
– Tehnik kolom hidrostatis dikenal dan
dipasarkan dengan nama
Centrifugal partition
chromatograph (CPCs)
SISTEM HIDRODINAMIK

– Sistem hidrodinamik menggunakan prinsip yang

sama kecuali pada sistem ini kumparan berotasi pada
sumbunya menghasilkan gaya sentrifugal
– Dua fasa pelarut terdistribusi secara merata di setiap
putaran heliks dimana pelarut ini tercampur dengan
kuat oleh adanya rotasi kumparan.
– Gaya sentrifugal ini digunakan untuk
mempertahankan fase diam yang berbentuk cair,
sedangkan fase gerak yang juga cair didorong
melaluinya.
– Sehingga, solut akan terpisah secara efisien dan
terelusi berdasarkan koefisien partisi
– Sistem kolom ini sering disebut High Speed CCC
(HSCCC)
SISTEM HIDRODINAMIK
SISTEM PELARUT

Faktor-faktor yang harus diperhatikan dalam memilih sistem

pelarut;
– Kelarutan sampel dalam sistem pelarut,
– Stabilitas sampel dalam sistem pelarut, waktu
– Settling/pengendapan dari sistem pelarut,
– Koefisien partisi sampel,
– Retensi yang memuaskan fase diam dalam kolom
SISTEM PELARUT

Baik air ataupun pelarut organik dari sistem cair dua fasa
dapat digunakan sebagai fasa gerak. kriteria yang harus
dimiliki adalah :
1. Pelarut yang digunakan harus membentuk dua fasa yang
tidak bercampur
2. Harus tahan dengan kondisi kolom CCC
3. Sampel harus dapat terpisah pada sistem cair dua fasa
yang dipilih
JENIS CCC
 Rotation locular counter-
current chromatography
(RLCC)
– RLCC adalah metode kromatografi cair yang dikembangkan
oleh Ito dan Bowman.
– Penggunaan RLCC dalam isolasi beberapa produk alam
telah banyak dilaporkan.
– RLCC menunjukkan pemisahan kromatografi yang rendah
dan akibatnya jarang digunakan sebagai metode tunggal
untuk isolasi senyawa murni
Droplet Counter-Current
Chromatography (DCCC)

– Kromatografi yang memisahkan komponen sampel sesuai

dengan koefisien distribusinya
– Fase dari sistem pelarut yang digunakan salah satunya
disebut sebagai '' Fase diam '' yang ada di dalam kolom.
– Sedangkan yang lainnya sebagai fase gerak yang melewati
fase diam dalam bentuk tetesan kecil.
Centrifugal Partition
Chromatography (CPC)

– merupakan sistem partisi cair-cair berlawanan

– Solut dipisahkan diantara dua fasa di dalam kolom yang
berputar pada sumbunya
TERIMAKASIH