KROMATOGRAFI

Pemisahan campuran senyawa menjadi senyawa murninya dan mengetahui

kuantitasnya merupakan masalah penting dari pekerjaan di laboratprium
kimia

Teknologi yang penting untuk analisis dan pemisahan preparatif pada

campuran bahan adalah kromatografi

Teknik pemisahan ini pertama kali diperkenalkan oleh Michael Tswett

seorang dosen botani di Universitas Warsawa
◦ Tswett memisahkan pigmen tumbuhan
(klorofil dan xantofil) dalam suatu kolom
kaca berisi natrium karbonat.
◦ Warna yang terbentuk akibat elusi pelarut
organik membentuk pita-pita berwarna
dalam kolom
◦ Teknik tersebut diberi nama
kromatografi (chroma – warna, graphien
– tulisan)
Definisi kromatografi
Famakope Indonesia IV 1995 hal 1002

Prosedur pemisahan zat terlarut oleh proses migrasi diferensial dinamis dalam
sistem yang terdiri dari dua fase atau lebih, salah satunya bergerak secara
berkesinambungan dalam arah tertentu dan di dalamnya zat-zat itu menunjukkan
perbedaan mobilitas disebabkan adanya perbedaan dalam adsorpsi, partisi,
kelarutan, tekanan uap, ukuran molekul, atau kerapatan muatan ion, dengan
demikian masing-masing zat dapat diidentifikasi atau ditetapkan dengan metode
analitik
Yang terlibat dalam kromatografi
◦ Zat terlarut, yang didistribusi antara dua fase
◦ Dua fase : fase diam dan fase gerak
◦ Fase gerak membawa zat terlarut melalui media hingga terpisah dari zat terlarut lainnya yang
terelusi lebih awal atau lebih akhir
◦ Zat terlarut dibawa melewati fase padat oleh pelarut dalam bentuk cair atau gas, disebut ELUEN
atau fase Gerak
◦ Fase diam bertindak sebagai penjerap(adsorben) atau cairan sehingga terjadi partisi antara kedua
fase
Klasifikasi
◦ Berdasarkan geometri :
◦ Kromatografi kolom dan kromatografi planar
◦ Berdasarkan sifat fisika sampel :
◦ Kromatografi gas ( sampel harus menguap agar terbawa oleh fase gerak gas)
◦ Kromatografi cair (sampel harus larut dalam pelarut organik atau air, komponen fase gerak)
 pemisahan pencirian
sampel kromatogram

kromatografi

Aplikasi:
Identifikasi
Kemurnian
Penetapan kadar
Pembagian kromatografi

KROMATOGRAFI GAS

KROMATOGRAFI KROMATOGRAFI CAIR SUPER KRITIK

KROMATOGRAFI CAIR
 KROMATOGRAFI GAS

Berdasar fase diam

PADAT
(KGP)
KOLOM

CAIR (yang melekat pada

pendukung padat)(KGC)

• ADSORPSI (KGP)
Berdasar mekanisme
pemisahan • PARTISI (KGC)
KROMATOGRAFI CAIR SUPER
KRITIK (fase gerak berupa gas
pada pada suhu dan tekanan di atas
titik kritisnya)

kolom

partisi
 Kromatografi cair
padat

kolom planar

cair

• Klasik (kolom besar)

• Kinerja tinggi - HPLC • Kertas
• Lapis tipis

• Adsorpsi
• Partisi
• Fase terikat
• Penekan ion • Adsorpsi
• Pasangan ion • Partisisi
• Pertukaran ion • Khiralitas (stereoisomer)
• Eksklusi ukuran
• Afinitas
• Khiralitas
Perbedaan kromatografi berdasar BM sampel

Kromatografi gas (sampel harus dapat

menguap /dibuat berfase gas)

Kromatografi cair (adsorpsi, partisi, fase

terikat, pertukaran ion, pasangan ion )

Kromatografi cair (sampel berupa senya yang dapat larut dalam air atau pelarut
organik)

0 50 500 10.000 >> 106

Kromatografi gas
◦ Fase gerak : hanya membawa analit melalui fase diam
◦ Laju aliran : berpengaruh pada pemisahan
◦ Fase diam : sangat berperan atau turut serta dalam proses pemisahan sampel
◦ Suhu : (injektor, kolom, detektor) berpengaruh pada pemisahan
Kromatografi cair
◦ Sampel, fase diam, dan fase gerak semuanya berinteraksi dalam
pemisahan sehingga lenih intensif (terutama polaritas, ukuran
molekul, afinitas, sifat permukaan fase diam dan gerak)
◦ Laju alir akan berpengaruh pada retensi
◦ Suhu akan berpengaruh pada waktu retensi
Mekanisme umum
◦ Pemisahan dicapai dengan mengendalikan dan menciptakan interaksi analis-fase gerak-fase diam
◦ Perbedaan migrasi analit karena mekanisme interaksi antara analit-fase diam-fase gerak
◦ Perbedaan migrasi menunjukkan waktu retensi relatif
◦ Pada kromatografi kolom : fase gerak mengalir karena adanya perbedaan tekanan di antara ujung kolom
◦ Pada kromatografi planar : fase gerak naik atau turun karena gaya kapiler atau gaya gravitasi
◦ Perbedaan interaksi atau afinitas antara komponen dengan kedua fase menyebabkan komponen -
komponenitu bergerak dengan kecepatan yang berdeda melalui kolom
◦ Komponen yang berinteraksi kuat dengan fase diam akan ditahan lebih lama dalam kolom dan yang lainnya
terbawa fase gerak dengan lau migrasi yang berbeda
Kromatografi kertas : suatu TLC (Thin Layer
Chromatography)
Prinsip kerja kromatografi kertas
GC (Gas Chromatography)
GLC (Gas Liquid Chromatogaphy)
◦ Fase gerak : gas
◦ Fase diam : cairan
◦ Bagian peralatan GC :
◦ Gas pembawa dan pemasukan sampel
◦ Kolom
◦ Detektor
◦ Jenis gas pembawa :
◦ He, H2, N2
◦ Gas pembawa yang cocok bergantung pada karakteristik detektor tersebut.
◦ Gas hidrogen dan helium digunakan pada detektor konduktivitas termal sedangkan nitrogen
digunakan pada detektor pengionan nyala.

◦ Sampel bisa berupa gas atau cairan volatil. Lubang injeksi dipanaskan
supaya sampel cair teruapkan dengan cepat
◦ Kolom berisi zat padat halus dengan luas muka besar yang inert
◦ Padatan terlebih dulu diimpregnasi dengan cairan yang merupakan
fasa diam yang sesungguhnya
◦ Cairan ini harus stabil dan non volatil pada temperatur kolom
◦ Detektor : untuk mendeteksi komponen-komponen keluar kolom
Teori GLC
Konsep pelat teoritis :
◦ Suatu komponen sampel akan terlarut di dalam cairan diam yang cocok : terdapat
kesetimbangan uap-cair
◦ Koefisien kesetimbangan : koefisien distribusi / koefisien partisi
◦ Terjadinya kesetimbangan dapat dibayangkan terjadi pada suatu pelat teoritis, dan
pada kolom kontinyu terdapat istilah HETP (Heigth Equivalen to a Theoretical
Plate)
Sistem pengambilan sampel
◦ Sampel-sampel cair : diinjeksikan melalui suatu karet septum dengan memakai suntikan syringe.
◦ Sampel-sampel gas : diinjeksikan atau dimasukkan dengan memakai bermacam-macam alat pengambilan
sampel gas yang dirancang untuk kromatograf komersial
kolom  Kolom Kapiler
- Merupakan tabung yang panjang dan tipis dari kaca atau bahan lainnya
seperti baja tahan karat.
- Hanya dapat menangani sampel-sampel yang sangat kecil, dan
penggunaannya secara luas menunggu pengembangan detektor yang sangat
sensitif.
 Kolom Isian
Fasa stasioner dalam GLC adalah cairan, tetapi cairan itu tidak boleh dibiarkan
bergerak-gerak di dalam tabung. Cairan tersebut harus diimobilisasi, biasanya
dalam bentuk suatu lapisan tipis dengan luas permukaan besar. Ini paling lazim
dilakukan dengan mengimpregnasi suatu bahan padat dengan fase cair kolom
diisi.
Kolom … (2)
◦ Pemilihan fasa cair
- Fasa cair stasioner harus dipilih dengan mempertimbangkan
masalah pemisahan tertentu.
- Fasa cair harus stabil secara termal pada temperatur kolom
(kecuali dalam kasus-kasus khusus), tidak bereaksi secara kimia
dengan komponen-komponen sampel, memiliki daya pelarut yang
cukup untuk sampel.
 STATIONARY PHASE APPLICATIONS

Polydimethyl siloxane
This is a general purpose nonpolar phase for separating
(Trade names are DB-1, HP-1, OV-1, and SE-
hydrocarbons, polynuclear aromatics, nonpolar drugs,
30)
chlorinated pesticides, and PCBs

Poly(phenylmethyldimethyl) siloxane (5-10% Still mostly nonpolar but with some polarity. Used to
phenyl) separate fatty acid methyl esters, alkaloids, drugs, and
(Trade names are DB-5, HP-5) halogenated chemicals

Poly(phenylmethyl) siloxane (50% phenyl) Slightly more polar. Used to separate more polar drugs,
(Trade names are DB-15 and OV-17) pesticides, and glycols

Poly(tritluoropropyldimethyl) siloxane (Trade Used to separate chlorinated aromatics nitroaromatics, and

names are DB-210 and OV-210 More polar. alkyl-substituted benzenes

The glycol functional group makes this phase considerably

Polyethylene glycol
polar. Used to separate free acid, alcohols, ethers, essential
(Trade names are DB-WAX and Carbowax)
oils, and glycols

Poly(dicyanoallyldimethyl) siloxane The most polar phase shown here. Used to separate
(Trade names are DB-1701 and OV-275) polyunsaturated fatty acids, free acids, and alcohols
 Resin for GC Packed Column

1/4-inch Glass Packed GC Column, a 1/8-inch Stainless Steel GC, and a

Fused Silica Capillary Column (from left to right).

Today most columns are fused silica

capillary columns with typical internal
diameters ranging from 0.25 to 0.53 mm.
Column lengths range from 5 to 100
meters.
 Detektor

◦ Detektor Integral
Memberikan suatu pengukuran setiap saat dari jumlah total bahan yang dielusi yang telah melewatinya
sampai waktu itu.

◦ Detektor Diferensial
Menghasilkan kromatogram familiar yang terdiri dari puncak-puncak dan bukan langkah-langkah.
Dibagi menjadi 2 kelas besar :
- detektor yang mengukur konsentrasi zat terlarut dengan memakai beberapa sifat fisika dari aliran gas
buangan
- detektor yang merespons secara langsung zat terlarut dengan demikian berarti mengukur laju alir
massanya.
Karakteristik detektor
◦ Kromatogram yang diperoleh dengan
detektor Integral

◦ Kromatogram yang diperoleh dengan

detektor diferensial
Jenis-jenis detektor
◦ Detektor Konduktivitas Termal
-Detektor yang banyak digunakan untuk GLC. Alat ini
mengandung : filamen logam yang dipanaskan maupun suatu termistor.

- Gas pembawanya adalah hidrogen

dan helium
- Detektor ini relatif sederhana,
tidak mahal, memiliki kepekaan
yang cukup bagi banyak kegunaan
 Jenis-jenis detektor …. (2)
◦ Detektor Pengionan Nyala
Prinsip dasar :
1. Energi kalor dalam hidrogen menyebabkan banyak molekul untuk mengionisasi
2. Gas efluen dari kolom dicampur dengan hidrogen dan dibakar pada ujung jet logam dalam udara
berlebih.
3. Potensial diberikan antara jet dan elektroda kedua yang bertempat di atas atau sekitar nyala itu.
4. Ketika ion-ion dibentuk dalam nyala, ruang gas antara kedua elektroda menjadi lebih konduktif, dan
arus yang meningkat mengalir dalam sirkuit.
5. Arus melewati resistor, tegangan terbentuk yang dikuatkan untuk menghasilkan isyarat yang diterima
perekam.
Jenis-jenis detektor … (3)

Gambar Detektor Pengionan Nyala

v
i
d
e
o
◦ Hasil respon detektor berupa pita elusi yang sesuai dengan distribusi Gauss
◦ tR retention time adalah waktu dari injeksi sampel sampai penampakan puncak pita elusi pada
detektor
◦ Pita yang sempit muncul dari kolom yang baik, sedang pita yang lebar muncul dari kolom yang
buruk
n, jumlah pelat teoritis kolom
2
 tR 
n = 5,54 
 w1/ 2 

2
 tR 
n = 16 
 wb 
◦ Sifat tak ideal :
Akibat adanya :
Difusi eddy
Difusi longitudinal
Ketidakseimbangan dalam perpindahan
massa
 Resolusi ( R ) :
kemampuan suatu kolom untuk dapat
memisahkan

2(t 2 − t1 )
R=
w1 + w2

Resolusi yang baik:

R > 1,5 → yaitu bila kedua puncak dapat terpisah dengan baik
Penerapan GLC
◦ Identifikasi senyawa :
Dalam suatu kolom tertentu, dengan semua variabel seperti laju alir dan temperatur
yang dikendalikan secara cermat, waktu retensi atau volume retensi merupakan
suatu besaran dari zat terlarut tersebut, yang dapat digunakan untuk mengetahui
suatu senyawa.
Dapat diintegrasikan dengan instrumen lain : misal GC-MS
Contoh
◦ Komponen hidrofilik pada biji
kopi panggang dipisahkan
secara efektif menggunakan
kolom enduro C18G dengan
0,5% asam fosfat dalam air
sebagai fase gerak .
Kromatogram tersebut
menunjukkan bentuk puncak
yang simetris untuk semua
komponen yang diuji
(trigonelline, quinic acid,
nicotinic acid dan citric acid).
◦ Analisis kuantitatif :
Hubungan antara zat terlarut dengan ukuran pita elusi yang dihasilkan
Dengan detektor diferensial ukuran jumlah zat terlarut adalah luas di bawah pita
elusi
◦ Pembatasan GLC
Volatilitas : sampel harus mempunyai tekanan uap yang cukup pada temperatur
kolom