HIGH PERFORMANCE LIQUID

CHROMATOGRAPHY (HPLC)
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)
 HPLC
Tujuan: Mahasiswa mampu memahami penggunaan dan
perawatan instrument HPLC
Bahan kajian:
1. Pengertian HPLC
2. Jenis-jenis HPLC
3. Penggunaan HPLC
4. Perawatan instrument HPLC
Instrument
 Apa itu HPLC?
Teknik pemisahan analitik yang paling banyak digunakan
Memanfaatkan fase gerak cair untuk memisahkan komponen campuran
menggunakan tekanan tinggi untuk mendorong pelarut melalui kolom. Fase
gerak dapat berupa padat atau cair.
Kepopuleran:
◦ Kepekaan
◦ Kemampuan untuk penentuan kuantitatif yang akurat
◦ Sesuai untuk memisahkan spesies yang tidak mudah menguap atau yang rapuh secara termal
◦ Dapat diaplikasikan secara luas pada senyawa-senyawa utama dalam industri, berbagai bidang ilmu pengetahuan,
dan publik
Apa itu HPLC? (sambungan)
Sangat cocok untuk pemisahan dan identifikasi asam amino, protein,
asam nukleat, hidrokarbon, karbohidrat, obat-obatan, pestisida, pigmen,
antibiotik, steroid, dan berbagai zat anorganik lainnya
Perbandingan dengan GC
PARAMETER GC HPLC
Dasar Interaksi solute dengan fase diam, tekanan Interaksi solute dengan fase
pemisahan uap solut diam dan fase gerak
Cepat (beberapa menit untuk campuran Lebih lama dari GC
Waktu analisis
sederhana)
Suhu untuk Biasanya memerlukan suhu > 40°C Biasanya pada suhu kamar
pemisahan
Pemisahan senyawa-senyawa volatile dan Pemisahan untuk senyawa-
stabil pada suhu tinggi. Tidak dapat senyawa yang lebih beragam-
Aplikasi
digunakan untuk senyawa dengan bobot bobot molekul tinggi dan
melekul tinggi dan sangat polar polar
Sejarah
Kromatografi awal dilakukan di kolom kaca
◦ diameter: 1-5 cm
◦ panjang: 50-500 cm
Ukuran fase diam padat
◦ diameter: 150-200 μm
Laju aliran masih rendah! Waktu pemisahan lama!
Eureka! Penurunan ukuran partikel dari pengepakan menyebabkan
peningkatan efisiensi kolom!
◦ diameter 3-10 μm
Teknologi ini membutuhkan instrumen yang canggih
◦ metode baru yang disebut HPLC
 Jenis-jenis HPLC
Liquid-solid (adsorption) chromatography
Liquid-liquid (partition) chromatography
Ion-exchange chromatography
Size exclusion chromatography

https://bitesizebio.com/30007/separation-column-chromatography-methods/
Teknik fase normal vs fase terbalik
Fase normal: Jika fase diam lebih polar dari fase gerak
Fase terbalik: Jika fasa diam kurang polar dibanding fase gerak
Jika komposisi fase gerak tetap konstan selama pemisahan HPLC,
pemisahan tersebut dianggap sebagai elusi isokratik
Gradien kromatografi adalah Teknik yang digunakan bila sampel
mengandung komponen dengan polaritas bervariasi dengan
mengubah rasio senyawa polar ke non-polar dalam fase gerak saat
proses elusi.
Instrument
Penampung fase gerak
Pompa
Penyuntik
Kolom
Detektor
Sistem pengolahan data
Fase gerak/pelarut
Biasanya campuran pelarut organik (Mis. Metanol, IPA) dan air
Kadang-kadang dibufferkan - menjaga zat terlarut dalam bentuk netral secara
elektrik
Polaritas pelarut mempengaruhi proses pemisahan

Fase gerak harus disaring (untuk mencegah padatan kecil mengendap di kepala
kolom) dan melalui proses pelepasan gas
(degassing)
 Degassing dilakukan dengan sparging helium
 Gelembung dapat mengganggu deteksi
Sistem pompa
Memberikan aliran konstan pelarut yang terus menerus melalui
injektor
Persyaratan
◦ keluaran tekanan 1000 - 6000 psi
◦ laju aliran mulai dari 0,1-10 mL / menit
◦ kontrol aliran dan reproduktifitas aliran 0,5% atau lebih baik
◦ komponen tahan korosi
Injector/penyuntik sampel
Untuk menginjeksikan sampel pada aliran fase gerak
Volume sampel yang disuntikkan harus kecil 0,1-500 μL
Kolom
Tempat pemisahan terjadi
Berbentuk tabung logam kecil (biasanya panjang 5 sampai 30 cm;
diameter 1-5 mm) yang berisi fase diam
 Kolom
Kolom HPLC Jauh lebih pendek dari kolom yang digunakan di GC ---
Mengapa?

Pemisahan yang sangat efisien dicapai dalam HPLC karena interaksi kedua fase (fase
gerak dan fase diam) dengan komponen campuran vs. GC, di mana hanya fase diam
yang berinteraksi dengan komponen
Detektor
Desain yang berbeda dari detektor GC karena komponen dilarutkan dalam fase
gas berwujud cair (vs. gas di GC)
Jenis-jenis detector:
Refractive index (indeks bias)
UV
Fluorescence
Conductivity
Evaporative light scattering
Electrochemical
UV detektor
Aplikasi: merespon zat yang menyerap cahaya pada kisaran 180
hingga 350 nm
Sebagian besar senyawa organik
◦ Sistem π (aromatik, alkena, alkuna)
◦ Karbonil
 Kromatogram HPLC

https://www.123rf.com/photo_41834721_stock-vector-hplc-chromatogram-example-of-food-additives-2d-
scientific-schedule-vector-.html
 Parameter kromatgrafi-Resolusi
Resolusi adalah derajat pemisahan dua komponen campuran dalam proses
kromatografi dinyatakan dengan istilah resolusi (Rs)

https://www.youtube.com/watch?v=JUwkB418I90&list=PLmRpOX9aPBrI7AhzM0RttLIWJbIg9C_lz&index=7
 PRAKTIKUM
Instrumen:
https://www.youtube.com/watch?v=VCcq5XQam9M
Penjelasan HPLC
https://www.youtube.com/channel/UCKn0ermlm3yoopuoyqsjn6Q/playlists
Insterpretasi kromatogram HPLC
https://www.youtube.com/watch?v=qXmSb6Xwr5k