HPLC

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Apt. Andre Prayoga, M.Farm

 Kemampuan yang diharapkan:

Mahasiswa mampu memahami tentang

HPLC atau KCKT
 Kriteria
Mampu memahami prinsip kerja alat
HPLC
Memahami fungsi peralatan
Mampu menangani cara penyiapan
sampel dan interpretasi hasilnya
 MATERI
1. Pembagian /Klasifikasi HPLC
2. Penggunaan /manfaat
3. Skema alat HPLC
4. Penjelasan masing-masing fungsi
 1. Klasifikasi berdasarkan
Mekanisme
Kromatografi adsorpsi
(adsorption chromatography)

Kromatografi Partisi
(partition chromatography)

Kromatografi Pertukaran ion

(ion exchange Chromatography)

Size Exclusion Chromatography (SEC)

Kromatografi Permeasi Gel; Kromatografi Filtrasi Gel
 Keunggulan HPLC
Kolom HPLC dpt dipakai berulangkali
tanpa perlu diregenerasi (diperbaharui)
Tercapainya pemisahan yg memuaskan
pd kolom
Dpt dioperasikan secara otomatis
Waktu analisis relatif singkat
HPLC The most frequently used technique

High Performance
HP High Pressure

L Liquid
Cairan sebagai Fase gerak

Chromatography
C  Teknik Pemisahan
 Berdasarkan sifat kimia Pemisahan
SEC
NP Size
Normal Exclusion
Phase (GPC, GFC)

RP
HILIC Ion
IE
Suppression
Ion
Reversed Ion pairing
Exchange
Phase HPLC

Dilakukan dengan instrumen HPLC yang sama,

tergantung dari kolom yang digunakan
 2. PENGGUNAAN/Manfaat
• Untuk senyawa organik yang tidak stabil bila dipanaskan

Prinsip
• Terdiri dari fasa diam, dg permukaan aktifnya berupa
padatan, larutan, resin penukar ion atau polimer berpori
• Fasa diam ditempatkan pd kolom serta dialiri fasa gerak
cair dg aliran yg diatur oleh pompa
• Terjadi Kompetisi 2 fasa
• Dilakukan pada T rendah
• Elusinya pada tekanan tinggi (hingga 5000 psi atau 300
atm)
3 .Skema Alat HPLC
Peralatan HPLC
 Fasa gerak (pelarut)
• Membutuhkan cukup banyak pelarut
• Sebelum pelarut digunakan dilakukan
degassing utk mengeluarkan gas terlarut yg
tdk diinginkan
• Adanya gas dlm pelarut dpt bereaksi dg fasa
gerak/fasa diam, dpt mengganggu krj detektor
• Fasa gerak harus bebas dari partikel debu krn
partikel2 kecil yg terbawa ke dalam pompa
atau masuk dlm kolom akan mempercepat
rusak pompa atau menyumbat kolom
• Fasa gerak disaring dg penyaring khusus yg
diameter porinya ± 0,45µm
 Fase Gerak

Fase Gerak Polaritas indeks

Toluen 2,4

Kloro benzen 2,7

Etil eter 2,8

Etil asetat 4,4

Aseton 5,1

Metanol 5,1
Asetonitril 5,8
Air 10,2
 Sistem Pompa
Tekanan sampai 6000 psi
Kontrol aliran 0,1-10 mL/menit
 HPLC: Berdasarkan komposisi fase gerak

Isokratik (Isocratic elution):

 Komposisi fase gerak tetap

Gradien (Gradient elution):

 Komposisi fase gerak berubah-ubah

Elusi gradien
% Solven B

Elusi Isokratik

Waktu (menit)
 Elusi gradien
Apabila suatu campuran senyawa yang kompleks
ingin dianalisa yang terdiri dari komponen-komponen
yang mempunyai afinitas yang sangat berbeda, sering
didapatkan pemisahan yang tidak sempurna apabila
digunakan sistim isokratik
Untuk memecahkan persoalan ini komposisi fasa
gerak dapat diubah selama proses pemisahan sesuai
dengan tingkat affinitas masing-masing komponen 
elusi gradien
Gradien elusi, dpt menggunakan lebih
dari dua pelarut yg secara otomatis dpt
diubah komposisinya sesuai
kebutuhan, sehingga diperoleh
pemisahan yg baik walau
menggunakan dua pompa
 Gradient Analysis
Keuntungan:
 Lebih baik untuk sampel campuran
 Memiliki resolusi yang lebih baik
 Kapasitas puncak lebih baik

Kerugian
 HPLC yang lebih kompleks
 Pengembangan Metode analisis dan implementasi
yang lebih rumit
 Penyesuaian kolom dengan fase gerak membutuhkan
waktu sehingga analisis menjadi
 Pengendali aliran(flow controller)

Dpt menstabilkan aliran fasa gerak akibat

perubahan tekanan gas, temperatur,
viskositas
Isokratik, cara pemrograman fasa gerak
yg hanya memerlukan 1 macam
komposisi pelarut baik pelarut tunggal
maupun pelarut campuran. Jika
digunakan 2 jenis pelarut maka
diperlukan 2 pompa utk mengatur pelarut
agar komposisinya tetap selama
pemisahan
 Alat Injeksi
Dirancang khusus sebab sistem HPLC
mempunyaai tekanan sangat tinggi
Bbrp HPLC dilengkapi peralatan injeksi
sampel yg dpt memasukkan sampel
secara otomatis sekaligus menjalankan
peralatan lain yg terangkai dlm sistem
tsb,dikenal auto injector. Alat ini
mampu menangani sampel dlm jumlah
puluhan buah
 Kolom
Tidak memerlukan suhu yg tinggi krn
sifat ikatan kimia thd fasa diam sangat
sensitif thd suhu tinggi
Fasa diam berikatan kimia dg lapisan
pendukung
Contoh 3,5 atau 10 µm silika hidrolisis
yg dilapiskan dg siloxan
R1

Si O
n

R2
Normal phase HPLC :
nonpolar solvent/polar colums.
Contoh R=hidrokarbon
Reversed phase HPLC :
polar solvent/nonpolar column.
Contoh R = cyano(C2H4CN)
diol (C3H6OCH2CHOHCH2OH)
amino (C3H6NH2)
 Detektor
Karakteristik detektor :
Tingginya sensitivitas yaitu lebih dari
0,1 µg sampel dlm 1 cm3
Tidak merusak sampel
Tidak sensitif thd perubahan
temperatur dan perubahan kecepatan
aliran fasa gerak
 Detektor Fotometer (UV, IR,
Fluoresence)
• Detektor UV dikhususkan pada senyawa yg
memiliki serapan maksimum di daerah UV
yaitu senyawa yg memiliki elektron ikatan ᴨ
dan elektron non ikatan seperti olefin,
aromatik, dan senyawa yang mengandung
gugus –C=O, -C=S, -N=O dan –N=N-
• Detektor IR dapat dipakai untuk mendeteksi
beberapa panjang gelombang yg dapat diatur
menurut gugus fungsinya. Panjang gelombang
tersebut pada daerah 4000-690 cm-1
Detektor fluoresence dipakai untuk
senyawa yg memiliki tingkat selektifitas
tinggi pada senyawa yg berfluoresence.
Senyawa ini umumnya memiliki
struktur siklik konyugasi spt
polinuklear aromatik, asam amino
aromatik, phenol, quinolin
 Detektor Refraktometer
Perbedaan detektor ini dari yg lain
adalah mampu memonitor perbedaan
indeks refraksi yg tdp dlm gasa gerak
dan fasa gerak-sampel ketika keluar
dari dalam kolom
Deteksi mampu dilakukan hingga
konsentrasi 1 ppm dlm larutan
 Detektor Konduktometer
Didasarkan pd adanya perbedaan daya
hantar listrik dari larutan yg
melewatinya
Khusus digunakan utk mengukur
larutan elektrolit yaitu pd kromatografi
penukar ion
Fasa geraknya biasanya air atau
larutan buffer
 Rekorder
Menggambarkan kromatogram
berdasarkan hasil yg diberikan oleh
detektor
Kolom HPLC
Kolom HPLC Berbagai ukuran
Teknik KCKT
- Pelarut
- Elusi dalam bentuk isokratik/gradien
- Kolom :
Silika Si–OH
Amino Si– (CH2)3 – NH2
Siano Si– (CH2)3 – CN
Diol Si– (CH2)2 – O – CH2 – CH – CH2
OH OH
RP-2 Si– (CH3)2
RP-8 Si– (CH2)7 – CH3
RP-18 Si– (CH2)7 – CH3
 R R R R
HO Si OH Si O Si O Si

O O O OH O O

Si O Si O Si O Si O Si
PERMUKAAN SILIKA
MACAM FASA GUGUS R

SILIKA – OH
RP – 2 – CH2 – CH3

RP – 8 – (CH2)7 – CH3
RP – 18 – (CH2)17 – CH3

AMINA – (CH2)3 – NH2

SIANO – (CH2)3 – C ≡ N
DIOL – (CH2)3 – O – CH2 – CH – CH2
I I
OH OH
 HPLC Fase Normal
 NP-HPLC: fase gerak non polar,
fase diam polar
 Disebut juga kromatografi
adsorpsi (adsorption
chromatography)
 Pemisahan didasarkan atas
adsorpsi/desorpsi analit pada
fase diam polar (silika atau
alumina)
 Analit polar lebih tertahan
daripada analit non polar karena
gugus silanol pada silika.
 HPLC Fase terbalik
 RP-HPLC: fase gerak polar, fase
diam non polar
 Pemisahan didasarkan atas
koefisien partisi analit dalam
fase diam dan fase gerak
 Urutan elusi: analit polar terelusi
lebih dahulu, analit non polar
terelusi terakhir
 Untuk pemisahan analit non
polar (non ionik)
 Untuk analit yang dapat
terionisasi (ionik) dapat
dianalisis dengan RP-HPLC
menggunakan pengaturan pH
fase gerak atau teknik pasangan
ion (ion-pair).
 Ion Exchange HPLC

 Pemisahan didasarkan atas

pertukaran ion analit dengan
ion dari gugus fungsi bahan
pendukung padat fase diam
 Contoh Fase diam: senyawa
sulfonate (penukar kation);
ammonium kuarterner
(penukar anion)
 Fase gerak: dapar
 Aplikasi: analisis ion, asam-
asam amino, protein/peptida,
polinukleotida
 Size Exclusion HPLC
 Untuk pemisahan
makromolekul (BM >
10000).
 Disebut GFC jika
digunakan untuk
pemisahan molekul
biologis yang larut air
 Fase gerak umumnya
toluen dan
tetrahidrofuran.
Pemisahan Kromatografi Cair
 Chromatogram

tR-B
Respon Detektor 

tR-A
Peak A Peak B

height

0 1 2 3 4 5 6 7
Waktu (menit) width

Area =
width x height
2
Waktu retensi kromatogram merupakan karakteristik suatu senyawa
tetapi tidak khas/ unik
 Dari Kromatogram diketahui:
Data :
 Kromatogram  tR: waktu retensi (retention
time)
 (parameter kualitatif)
tR-1
Respon Detektor

 Luas puncak = Peak area

tR-2  parameter kuantitatif

 Tinggi puncak (Peak height)

parameter kuantitatif
waktu

 Width = lebar puncak

Retention volume (VR)

VR = tR × F Relative Retention Time (RRT) = tR2/tR1
 Retensi senyawa yang tidak ditahan
 tM = to adalah waktu retensi zat yang tak
tertahan oleh fase diam
 VM = dead volume
  tM = Hold-Up time = dead time
 tR’ = tR – tM = adjusted retention time
 Lebar Puncak (w)
 Lebar garis dasar (baseline) = Wb
 Lebar tengah puncak (W0.5)
Tailing, Fronting & Symmetry Peak

a b
 Tailing Factor (USP)
Tailing Factor (Tf) = Symmetry Factor (As)

Tf = 1.0  Puncak simetri

Tf < 1.0  fronting
Tf > 2.0  tailing
 Hukum Van Deemter
H = A + B/ + C. 
 A= difusi Eddy; B=difusi longitudinal; C=
perpindahan massa; =kecepatan fase gerak
Hukum Van Deemter
 Eddy Diffusion

A = 2  dp

•disebut difusi Eddy

• tergantung pada distribusi
ukuran partikel
•Jika ukuran partikel packing seragam
  kecil
•dp = diameter partikel packing
 Longitudinal Diffusion (B)

B/u = 2DM/u

•  = konstan tergantung mutu packing

• DM = koefisien difusi fase gerak

• Berbanding terbalik dengan laju alir fase gerak
 Mass Transfer (Cs + Cm)

H = A + B/u + (Cs + Cm)u

CS = fS(k’)df2 / DS

CM = fM(k’)dp2 / DM

• DM = koefisien difusi fase gerak

• DS = koefisien difusi fase diam
• df = film thickness
• dp = diameter partikel
• Berbanding lurus dengan laju alir fase gerak