Tujuan Percobaan
1. Melakukan analisis kualitatif bahan baku dengan metode kromatografi cair kinerja
tinggi.
2. Melakukan analisis kuantitatif bahan baku dengan metode kromatografi cair kinerja
tinggi.
3. Menyimpulkan mutu bahan baku dengan data kromatogram dan hasil penetapan kadar.
2. Pemasukan cuplikan
Sampel yang dapat diamati dengan HPLC memiliki beberapa persyaratan, yaitu: a).
Senyawa-senyawa ionik; b). Senyawa-senyawa yang tak stabil (yang jika diuapkan akan
mengalami peruraian); c). Senyawa-senyawa dengan massa molekul yang besar.
Cuplikan yang dimasukkan harus sekecil mungkin, beberapa puluh L. Selain itu, perlu
diusahakan tekanan tidak menurun ketika memasukkan cuplikan ke dalam aliran fasa
gerak. Beberapa teknik pemasukkan cuplikan ke dalam sistem HPLC yaitu injeksi syringe,
injeksi stop flow, dan kran cupikan.
Untuk memasukan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak melalui dua langkah: 1)
sejumlah volume cuplikan disuntikkan ke dalam loop dalam posisi load, cuplikan masih
berada dalam loop. 2) kran diputar untuk mengubah posisi load menjadi posisi injeksi
dan fasa gerak melalui kolom.
3. Kolom
Kolom merupakan tempat berlangsungnya pemisahan komponen campuran. Kolom
HPLC biasanya terbuat dari stainless steel walaupun ada juga yang terbuat dari geals
berdinding tebal. Kolom utama berisi fasa diam, tempat terjaidnya pemisahan campuran
menjadi komponen-komponennya. Bergantung keperluannya, kolom utama dapat
digunakan untuk analisis atau preparasi. Untuk keperluan preparatif, setiap komponen yang
keluar dari kolom ditampung pada tabung yang berbeda dan keluaran HPLC dihubungkan
dengan fraction colectur. Kolom utama berisi fasa diam berupa cairan sukar menguap dan
stabil, misalnya C-18.
4. Detektor
Alat ini mendeteksi komponen-komponen yang meninggalkan kolom. Detektor HPLC
dikelompokkan ke dalam tiga jenis yaitu detektor umum memberi respon terhadap fasa
gerak yang dimodulasi dengan adanya solut, detektor spesifik memberi rewspon terhadap
beberapa sifa solut yang tidak dimiliki oleh fasa gerak. Terakhir, detektor yang bersifat
umum terhadap solut, setelah fasa gerak dihilangkan dengan penguapan. Ada beberapa
contoh detektor HPLC, diantaranya detektor UV, detektor elektrokimia, dan detektor
fluorometrik.
Persyaratan detektor HPLC :
a. Sensitif
b. Stabilitas dan keterulangan tinggi
c. Respon linear terhadap solut
d. Waktu respon pendek sehingga tidak tergantung kecepatan alir
Jenis-jenis HPLC:
1. Kromatografi adsorbsi
Kromatografi adsorbsi sangat cocok untuk pemisahan senyawa-senyawa yang agak
polar. Pertikel-partikel silika atau alumina biasanya digunakan sebagai adsorben. Gugus-
gugus polar silanol pada permukaan silika dan gugus polar aluminol pada permukaan
alumina bertindak sebagai tempat adsorbsi molekul-molekul polar. Jenis kromatografi ini
menggunaka fasa gerak nonpolar seperti heksana dan jenis kromatografi ini disebut juga
kromatografi fasa normal.
2. Kromatografi partisi
Pada kromatografi partisi, retensi solut dan pemisahan analog dengan ekstraksi cair-
cair. Konsentrasi solut dalam masing-masing fasa cair sinyatakan dengan koefisien partisi.
Biasanya fasa gerak lebih polar daripada fasa diam sehingga disebut kromatografi fasa
terbalik.
3. Kromatografi fasa terikat
Kromatografi fasa terikat merupakan teknik HPLC yang paling penting dan paling
banyak digunakan pada saat sekarang. Kromatografi fasa terikat dioperasikan dengan mode
fasa terbalik. Akan tetapi, sorben fasa terikat terdidi dari partikel silika akan dimodifikasi
secara kimia dengan rantai alkil.
4. Kromatografi penukar ion
Kromatografi penukar ion merupakan teknik pemisahan campuran ion-ion atau
molekul-molekul yang dapat di-ionkan. Ion-ion bersaing dengan ion fasa gerak untuk
memperebutkan tempat berikatan pada fasa diam.
5. Kromatografi ekslusi ukuran
Bahan:
Baku pembanding parasetamol
Bahan baku parasetamol
Methanol pro HPLC
Aqua Bidest
Kolom HPLC C18
IV. PROSEDUR
a. Sistem Kromatografi
Fase diam : ODS, packing L1
Fase gerak : air : methanol = 3:1 (v/v)
Laju alir : 1.5 mL/menit
Lempeng teoritis : 1000
Tailing factor : maksimal 2
Detector : UV 243 nm
c. Analisis Sampel
Larutan Standar
Timbang dengan seksama 25 mg baku pembanding parasetamol ke dalam labu takar 50
mL. Encerkan dengan fase gerak hongga tanda batas. Kocok larutan hingga homogen
(larutan stok baku pembanding parasetamol).
Buat serangkaianpengenceran larutan standar untuk pembuatan kurva kalibrasi. Pipet
masing-masing 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; dan 1,0 larutan stok baku pembanding ke dalam labu
takar 10 mL. Encerkan dengan fase gerak hingga tanda batas. Saring larutan dengan
membran filter PTFE ukuran 0.45m. Larutan siap untuk diinjeksikan ke dalam alat
KCKT. Hitung konsentrasi masing-masing larutan kurva kalibrasi.
Larutan Uji
Timbang dengan seksama 25 mg bahan baku parasetamol ke dalam labu takar 50 mL.
Encerkan dengan fase gerak hongga tanda batas. Kocok larutan hingga homogeny.
Pipet 1,0 mL larutan ke dalam labu takar 10 mL. Encerkan dengan fase gerak hingga
tanda batas. Saring larutan dengan membran filter nilon ukuran 0.45m. Larutan siap
untuk diinjeksikan ke dalam alat KCKT.
V. HASIL PENGAMATAN
Larutan Standar
No. Konsentrasi Waktu Retensi Luas Area
1 10 ppm 8,801 1106
2 20 ppm 8,753 91632
3 30 ppm 8,743 138176
4 40 ppm 8,736 12476
5 50 ppm 8,721 60489
80000
60000
40000
20000
0
0 10 20 30 40 50 60
Konsentrasi (ppm)
96101
8,704
WAKTU RETENSI AREA
Series1
217593
8.714
WAKTU RETENSI LUAS AREA
Series1
143517
8,701
WAKTU RETENSI LUAS AREA
Series1
X = 11. 92 ppm
X = 23,89 ppm
X = 42,59 ppm
KET :
Cu : konsentrasi larutan uji
Laporan Praktikum ANFISKO Page 11
Lu : luas area kromatogram larutan standar
Ls : luas area Kromatogram larutan uji
Cs : konsentrasi larutan standar
= 19,07 ppm
= 28,88 ppm
KADAR LARUTAN UJI ( SERBUK PARACETAMOL)
Lu
Cu = x Cs
138176
Cu = 217593 x 30 ppm
= 19. 05 ppm
VI. PEMBAHASAN
Dalam pembuatan larutan induk parasetamol, pembuatannya harus dilakukan dalam
satu kali pengerjaan, artinya untuk membuat larutan standar parasetamol dan untuk
keperluan pengenceran sampel harus menggunakan larutan induk parasetamol yang sama.
Hal tersebut dilakukan untuk menjaga agar peak yang ditunjukkan kromatogram sampel
memungkinkan masih berada dalam rentang konsentrasi larutan standar yang dibuat.
Selain itu, baik dalam pembuatan larutan induk parasetamol, larutan standar
parasetamol maupun sampel harus dihomogenkan, supaya larutan benar-benar bercampur
sempurna (merata). Larutan standar dan sampel juga harus didegassing untuk
menghilangkan gas-gas yang kemungkinan ada dalam larutan tersebut. Hal itu dilakukan
Pertanyaan :
Jawaban :
1. Prinsip dasar dari HPLC adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya.
Adapun prinsip kerja dari alat HPLC adalah ketika suatu sampel yang akan diuji
diinjeksikan ke dalam kolom maka sampel tersebut kemudian akan terurai dan terpisah
menjadi senyawa-senyawa kimia ( analit ) sesuai dengan perbedaan afinitasnya. Hasil
pemisahan tersebut kemudian akan dideteksi oleh detector (spektrofotometer UV,
fluorometer atau indeks bias) pada panjang gelombang tertentu, hasil yang muncul dari
detektor tersebut selanjutnya dicatat oleh recorder yang biasanya dapat ditampilkan
2. Sistem yang digunakan yaitu kromatografi partisi, Prinsip kromatografi partisi dapat
dijelaskan dengan hukum partisi yang dapat diterapkan pada sistem multikomponen yang
dibahas di bagian sebelumnya. Dalam kromatografi partisi, ekstraksi terjadi berulang
dalam satu kali proses. Dalam percobaan, zat terlarut didistribusikan antara fasa stationer
dan fasa mobil. Fasa stationer dalam banyak kasus pelarut diadsorbsi pada adsorben dan
fasa mobil adalah molekul pelarut yang ;mengisi ruang antar-partikel yang ter adsorbsi.
Contoh khas kromatografi partisi adalah kromatografi kolom yang digunakan luas karena
merupakan sangat efisien untuk pemisahan senyawa organik
Kolomnya (tabung gela) diisi dengan bahan seperti alumina, silika gel atau pati
yang dicampur dengan adsorberf, dan pastanya diisikan kedalam kolom. Larutan sampel
kemudian diisikan kedalam kolom dari atas sehingga sammpel diasorbsi oleh adsorben.
Kemudian', pelarut (fasa mobil; pembawa) ditambahkan tetes demi tetes dari atas kolom.
Partisi zat terlarut berlangsung di pelarut yang turun ke bawah (fasa mobil) dan
pelarut yang teradsorbsi' oleh adsorben (fasa stationer). Selama perjalanan turun, zat
terlarut akan rnengalami proses adsorpsi dan partisi berulang-ulang. Laju penurunan
berbeda untuk masing-masing zat terlarut dan bergantung pada koefisien partisi masing-
masing zat terlarut. Akhirnya, zat terlarut akan terpisahkan membentuk beberapa
lapisan.Akhirnya, masing-masing lapisan dielusi dengan pelarut yang,pocok untuk
memberikan spesimen murninya. Nilai R didefinisikan untuk tiap zat'etra'.lrut dengan
persamaan berikut.
Teknik yang dilakukan pada percobaan ini merupakan reverse phase atau
fasa terbalik karena teknik ini menggunakan pelarut polar sebagai fasa gerak sedangkan
fasa diamnya menggunakan pelarut non polar
2. 20 ppm
3. 30 ppm
4. 40 ppm
5. 50 ppm