HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY -HPLC

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI - KCKT

UNIVERSITAS HAMKA

2021
 Di dalam Al-Quran terdapat beratus-ratus ayat yang menyebut tentang
ilmu pengetahuan dan sains yang merupakan salah satu isi pokok
kandungan kitab suci Al-Qur’an. Bahkan kata ‘ilm dan turunannya
disebut sebanyak 778 kali. Selain itu sains juga merupakan salah satu
AYAT AL kebutuhan agama Islam, hal ini dibuktikan dengan fakta setiap kali umat
QURA’AN DAN Islam melaksanakan ibadah memerlukan penentuan waktu yang
tepat.Contohnya dalam melaksanakan shalat
AJAKAN UNTUK
BERPIKIR
TENTANG ALAM
DAN ILMU
PENGETAHUAN

Alam semesta berawal dari sebuah "ledakan besar" dan kristalisasi materinya membentuk bintang dan planet.
POKOK BAHASAN

 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

- Pengertian/prinsip kerja HPLC

- Sistem peralatan HPLC (Fase gerak, fase diam

waktu retensi, dsb)
 Sistem elusi HPLC
 Penanganan sampel dan cara analisis
 Menjelaskan prinsip kerja alat
HPLC
MAHASISWA
DIHARAPKAN
MAMPU:
System peralatan

Cara penanganan sampel pada

analisis menggunakan HPLC
Pengertian/prinsip kerja HPLC
 Analit

Inter-
aksi

Fase Fase
Diam Gerak

Like interacts Like

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) ATAU
HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

• High berarti tinggi
• Pressure berarti tekanan
• Liquid memiliki arti cairan, dan
• Chromatography merupakan suatu metode tentang pemisahan molekul.
 Kromatografi cair kinerja tinggi merupakan salah satu metode
pemisahan molekul dengan media cair yang biasanya disertai dengan
tekanan tinggi. Seperti teknik kromatografi pada umumnya, HPLC
digunakan untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan
afinitasnya terhadap zat padat (fase diam) tertentu.
 Seiring dengan perkembangannya, HPLC(High Pressure Liquid
Chromatography) bertransformasi menjadi High Performance Liquid
Chromatography.
 Alat ini dapat dikombinasi dengan alat deteksi sesuai dengan kebutuhan
KEUNGGULAN METODE HPLC/KCKT
DIBANDINGKAN DENGAN METODE PEMISAHAN
LAINNYA

 Kolom HPLC dpt dipakai berulangkali tanpa perlu diregenerasi

(diperbaharui)
 Tercapainya pemisahan yg baik terjadi di kolom

 Dapat dioperasikan secara otomatis

 Waktu analisis relatif singkat dibandingkan teknis analisis lainnya

PENGGUNAAN/Manfaat
• Untuk analisis senyawa organik yang tidak stabil bila
dipanaskan
SISTEM PERALATAN HPLC
SKEMA ALAT HPLC
PERALATAN HPLC

1. Tempat 3. Tempat
Fase 2. Pompa injeksi
Gerak/Eluen sampel

6. Rekorder 5. Detektor 4. Kolom

 • Fase gerak merupakan pelarut/campuran pelarut yang
diletakkan dalam wadah botol secara terpisah atau
telah dicampurkan
• Sebelum FG digunakan dilakukan degassing

A. FASA GERAK (diberikan getaran) utk mengeluarkan gas terlarut

• Adanya gas dalam FG dapat menempel pada fasa
(FG) gerak/fasa diam, sehingga dapat mengganggu kerja
kolom maupun detektor
ATAU MOBILE PHASE • Fasa gerak harus bebas dari partikel debu karena
partikel2 kecil yg terbawa ke dalam pompa atau masuk
dlm kolom akan mempercepat rusak pompa atau
menyumbat kolom
• Fasa gerak disaring dg penyaring khusus dengan
diameter porinya ± 0,45µm
 Fase Gerak Polaritas indeks
Toluen 2,4
Kloro benzen 2,7
BEBERAPA
CONTOH FASE Etil eter 2,8
GERAK YG Etil asetat 4,4
BANYAK Aseton 5,1
DIGUNAKAN Metanol 5,1
Asetonitril 5,8
Air 10,2
  Pompa berfungsi untuk mendistribusikan fase
gerak maupun sample dengan tekanan yang
tinggi ke bagian-bagian lainnya. Tekanan
berkisar antara 6000-9000psi

B. POMPA  Sebelum melakukan analisis (sample belum

dimasukan kedalam fase gerak) harus dilihat
base line (ada nilai slope yang harus
dipenuhi). Nilai ini bergantung dari masing-
masing alat/instrument
 Ketika base line sudah stabil maka auto
sampler mulai menjalankan algoritma injeksi
sample atau disuntikkan secara manual.
 C.ALAT
INJEKSI/INJECTOR
Berguna untuk memasukkan sampel ke dalam kolom

Injector manual

Beberapa HPLC dilengkapi

peralatan injeksi sampel yg dpt
memasukkan sampel secara
Dirancang khusus sebab sistem
otomatis sekaligus menjalankan
HPLC mempunyaai tekanan sangat
peralatan lain yg terangkai dlm
tinggi
sistem tsb,dikenal auto injector. Alat
ini mampu menangani sampel dlm
jumlah puluhan buah

Automatic Injector
 Kolom merupakan jantungnya KCKT

Kolom dapat disimpan dalam satu ruang oven yang akan

mengkondisikan suhu supaya temperatur fase gerak maupun
sample berada pada rentang yang sesuai

D. KOLOM Suhu dapat diatur sedemikian rupa (biasanya < 50C) dan tidak
memerlukan suhu yg tinggi karena sifat ikatan kimia thd fasa diam
sangat sensitif terhadap suhu tinggi
Fasa diam berikatan kimia dengan lapisan pendukung
(penyanggan dimana fase dian dilekatkan)

Contoh 3,5 atau 10 µm silika hidrolisis yg dilapiskan dengan

siloxan
KOLOM HPLC
KOLOM

Normal
Kolom polar / fase gerak non polar
phase Contoh : R=hidrokarbon
HPLC :

Reversed Kolom non polar / fase gerak polar

phase Contoh R = cyano(C2H4CN); diol (C3H6OCH2CHOHCH2OH); amino
HPLC : (C3H6NH2)
 R R R R
PERMUKAAN SILIKA
HO Si OH Si O Si O Si

O O O OH O O

Si O Si O Si O Si O Si

MACAM FASA GUGUS R

SILIKA – OH
RP – 2 – CH2 – CH3

RP – 8 – (CH2)7 – CH3
RP – 18 – (CH2)17 – CH3

AMINA – (CH2)3 – NH2

SIANO – (CH2)3 – C ≡ N
DIOL – (CH2)3 – O – CH2 – CH – CH2
I I
OH OH
SEBAGAI ILUSTRASI
Jl. I Gusti Ngurah Rai
MALL

Restaurant FINISH
START
PEMISAHAN KROMATOGRAFI CAIR
 BERDASARKAN SIFAT KIMIA PEMISAHAN
SEC
NP Size
Normal
Phase HPLC Exclusion
(GPC, GFC)

RP
HILIC Ion
IE
Suppression
Ion
Reversed Ion pairing
Exchange
Phase HPLC

Dilakukan dengan instrumen HPLC yang sama,

tergantung dari kolom yang digunakan
HPLC FASE NORMAL

 NP-HPLC: fase gerak non polar, fase

diam polar
 Disebut juga kromatografi adsorpsi
(adsorption chromatography)
 Pemisahan didasarkan atas
adsorpsi/desorpsi analit pada fase diam
polar (silika atau alumina)
 Analit polar lebih tertahan daripada
analit non polar karena gugus silanol
pada silika.
 HPLC FASE TERBALIK

 RP-HPLC: fase gerak polar, fase diam

non polar
 Pemisahan didasarkan atas koefisien
partisi analit dalam fase diam dan fase
gerak
 Urutan elusi: analit polar terelusi lebih
dahulu, analit non polar terelusi terakhir
 Untuk pemisahan analit non polar (non
ionik)
 Untuk analit yang dapat terionisasi
(ionik) dapat dianalisis dengan RP-HPLC
menggunakan pengaturan pH fase gerak
atau teknik pasangan ion (ion-pair).
A: senyawa non polar
B: senyawa semi polar
C: senyawa polar
ION EXCHANGE HPLC

 Pemisahan didasarkan atas pertukaran ion analit

dengan ion dari gugus fungsi bahan pendukung
padat fase diam (kekuatan relatif yg terjadi)
 Contoh Fase diam: senyawa sulfonate (penukar
kation); ammonium kuarterner (penukar anion)
 HPLC penukar anion maka fase diamnya
bermuatan positif. Begitu sebaliknya.
 Fase gerak: dapar
 Aplikasi: analisis ion, asam-asam amino,
protein/peptida, polinukleotida
ION EXCHANGE HPLC
 SIZE EXCLUSION HPLC
 Merupakan metode  kromatografi yang menggunakan partikel berpori
untuk memisahkan molekul dengan  ukuran yang berbeda.
 Untuk pemisahan makromolekul (BM > 10000).
 Disebut GFC jika digunakan untuk pemisahan molekul biologis yang larut
air
 Fase gerak umumnya toluen dan tetrahidrofuran.
Mekanisme
 Molekul yang lebih kecil dari ukuran pori dapat memasuki partikel dan
mempunyai  jalur dan waktu transit yang lebih panjang dibandingkan
molekul besar yang tidak  dapat memasuki partikel. Semua molekul yang
lebih besar dari ukuran pori tidak  tertahan dan terelusi bersama. Molekul
yang memasuki pori akan mempunyai waktu  tinggal dalam partikel yang
tergantung pada ukuran dan bentuk molekul. Molekul  yang berbeda
mempunyai waktu transit yang berbeda untuk melewati kolom.
 Molekul yang tidak dapat memasuki pori akan memerlukan volume fase
gerak lebih banyak untuk dapat keluar dari kolom
E. DETEKTOR

01 02 03
Sensitivitas yang Tidak merusak Tidak sensitif thd
tinggi yaitu lebih dari sampel perubahan temperatur
0,1 µg sampel dlm 1 dan perubahan
cm3 kecepatan aliran fasa
gerak
 Detektor UV dikhususkan pada senyawa yg memiliki serapan
maksimum di daerah UV yaitu senyawa yg memiliki elektron ikatan
ᴨ dan elektron non ikatan seperti olefin, aromatik, dan senyawa yang
mengandung gugus –C=O, -C=S, -N=O dan –N=N-
DETEKTOR
FOTOMETER Detektor IR dapat dipakai untuk mendeteksi beberapa panjang
(UV, IR, gelombang yg dapat diatur menurut gugus fungsinya. Panjang
gelombang tersebut pada daerah 4000-690 cm-1
FLUORESENCE)
Detektor fluoresence dipakai untuk senyawa yg memiliki tingkat
selektifitas tinggi pada senyawa yg berfluoresence. Senyawa ini
umumnya memiliki struktur siklik konyugasi spt polinuklear
aromatik, asam amino aromatik, phenol, quinolin
DETEKTOR REFRAKTOMETER
 Perbedaan detektor ini dari yg lain adalah mampu memonitor perbedaan indeks refraksi yg terdapat dlm fasa gerak dan
fasa gerak-sampel ketika keluar dari dalam kolom
 Deteksi mampu dilakukan hingga konsentrasi 1 ppm dlm larutan

DETEKTOR KONDUKTOMETER
 Didasarkan pada adanya perbedaan daya hantar listrik dari larutan yg melewatinya
 Khusus digunakan utk mengukur larutan elektrolit yaitu pd kromatografi penukar ion
 Fasa geraknya biasanya air atau larutan buffer
F. REKORDER

 Menggambarkan kromatogram berdasarkan hasil yg diberikan oleh detektor

SISTEM ELUSI HPLC
Sistem Pompa HPLC: Berdasarkan komposisi fase gerak/elusi
a. Isokratik (Isocratic elution):
 Komposisi fase gerak tetap
b. Gradien (Gradient elution):
 Komposisi fase gerak berubah-ubah

Elusi gradien
% Komposisi FG

Elusi Isokratik

Waktu (menit)
A. ELUSI GRADIEN

Apabila suatu campuran senyawa yang kompleks ingin dianalisa yang terdiri dari
komponen-komponen yang mempunyai afinitas yang sangat berbeda, sering didapatkan
pemisahan yang tidak sempurna apabila digunakan sistim isokratik

Untuk memecahkan persoalan ini komposisi fasa gerak dapat diubah selama proses
pemisahan sesuai dengan tingkat affinitas masing-masing komponen

Dapat menggunakan lebih dari dua pelarut yg secara otomatis dpt diubah komposisinya
sesuai kebutuhan, sehingga diperoleh pemisahan yg baik. Biasanya menggunakan dua
pompa FG.
 Keuntungan:
 Lebih baik untuk sampel campuran
 Memiliki resolusi yang lebih baik
 Kapasitas puncak lebih baik

ELUSI GRADIEN Kerugian

 Sistem pengaturan pd HPLC lebih kompleks

Contoh komposisi FG  Pengembangan Metode analisis dan implementasi lebih

Asetoni Air(%) Waktu rumit
tril (%) (menit)  Penyesuaian kolom dengan fase gerak membutuhkan
90 10 0-5 waktu sehingga analisis menjadi lebih lama
70 30 5 -10
65 35 10-15
90 10 15-20
Contoh komposisi FG pada elusi gradien
  Isokratik, cara pengaturan fasa gerak yg hanya
memerlukan 1 macam komposisi pelarut baik pelarut
tunggal maupun pelarut campuran. (komposisi pelarut
sama dari mulai analisis hingga selesai)
B. ELUSI  Jika digunakan 2 jenis pelarut maka diperlukan 2
ISOKRATIK pompa utk mengatur pelarut agar komposisinya tetap
selama pemisahan
 Contoh: Metanol : Air: Asetonitril dengan
perbandingan 50:10:40
INTERPRETASI
KROMATOGRAM
 Data :
DARI KROMATOGRAM DIKETAHUI:  tR: waktu retensi (retention time)
Kromatogram
 (parameter kualitatif)

tR-1
Respon Detektor

 Luas puncak = Peak area

 parameter kuantitatif

tR-2
 Tinggi puncak (Peak height)
parameter kuantitatif
waktu

 Width = lebar puncak

Retention volume (VR)

VR = tR × F Relative Retention Time (RRT) = tR2/tR1
CHROMATOGRAM
tR-B

Respon Detektor 
tR-A
Peak A Peak B

height

0 1 2 3 4 5 6 7
Waktu (menit) width

Area =
width x height
2
Waktu retensi kromatogram merupakan karakteristik suatu senyawa
tetapi tidak khas/ unik
LEBAR PUNCAK (W)

 Lebar garis dasar (baseline) = Wb

 Lebar tengah puncak (W0.5)
 RETENSI SENYAWA YANG TIDAK DITAHAN

 tM = to adalah waktu retensi zat yang tak tertahan oleh fase diam
 VM = dead volume
  tM = Hold-Up time = dead time
 tR’ = tR – tM = adjusted retention time
TAILING, FRONTING & SYMMETRY PEAK

a b
TAILING FACTOR (USP)

Tailing Factor (Tf) = Symmetry Factor (As)

Tf = 1.0  Puncak simetri

Tf < 1.0  fronting
Tf > 2.0  tailing
PENANGANAN SAMPEL DAN CARA ANALISIS
CARA PENANGANAN SAMPEL

Sampel berupa krim atau

Sampel berupa padatan emulsi perlu dilarutkan
Sampel berupa larutan
perlu dihancurkan dan dan dipisahkan dari
dapat diencerkan
dilarutkan , disaring pembawa yang dapat
merusak kolom
PK THIAMFENIKOL
KAPSUL
SIT DOLOR AMET
CARA KERJA

 Larutan Uji

 Timbang bobot 20 kapsul. Keluarkan isi kapsul dan timbang serbuk kapsul. Hitung bobot rata2 kapsul.

 11,0422 gr/20= 552,11

 Penyiapan larutan uji:

 Timbang setara 50 mg thiamfenikol, masukkan k dalam labu tentukur. Tambahkan air sd tanda, kocok. Sentrifus dan ambil 5,0
mL beningan dan masukkan ke dalam labu tentukur 50 mL dan tambahkan air sampai tanda.

 Larutan baku

 10 mg baku thiamfenikol dimasukkan ke dalam labu tentukur 10 mL dan encerkan dengan FG. Pipet 5 mL dan encerkan
dengan FG sd 50 mL.
Terima Kasih