PRAKTIKUM KIMIA PEMISAHAN DAN PENGUKURAN

PENENTUAN KADAR KAFEIN DAN NATRIUM BENZOAT DALAM MINUMAN

BERENERGI DENGAN MENGGUNAKAN TEKNIK KROMATOGRAFI CAIR
KINERJA TINGGI (HPLC)
diajukan untuk memenuhi salah satu tugas mata kuliah Praktikum Kimia Pemisahan dan
Pengukuran

Dosen pengampu: Dr. Soja Siti Fatimah, S.Si., M.Si.

Drs. Hokcu Suhanda, M.Si.

Tanggal Percobaan : Awal :

Akhir :

Disusun oleh
Shofiya Amamah Fajriani (1808486)

PROGRAM STUDI KIMIA

DEPARTEMEN PENDIDIKAN KIMIA
FAKULTAS PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS PENDIDIKAN INDONESIA
BANDUNG
2020
PENENTUAN KADAR KAFEIN DAN NATRIUM BENZOAT DALAM MINUMAN
BERENERGI DENGAN MENGGUNAKAN TEKNIK KROMATOGRAFI CAIR
KINERJA TINGGI (HPLC)

Tanggal Praktikum
 Awal :
 Akhir :

A. Tujuan
a. Dapat memahami cara kerja instrument HPLC untuk analisis kuantitatif.
b. Dapat melakukan preparasi dengan tepat dan akurat, serta dapat mengikuti menual
pengoperasian HPLC.
c. Dapat menentukan atau menghitung kadar zat aditif dalam sampel muman.

B. Prinsip Dasar

Teknik HPLC merupakan suatu metode komatografi cair-cair, yang dapat

digunakan baik unutk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis
kuantitatif dengan teknik HPLC didasarkan pada pengukuran luar area puncak analit
dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas area standar.pada prakteknya, metode
pembandingan area standard dan sampel kurang menghasilkan data yang akurat bila
hana melibatkan satu konsentrasi standar.oleh karena itu, dilakukan dengan
menggunakan teknik kurva kalibrasi.
Terdapat berbagai zat aditif yang digunakan oleh produsen makanan dan
minuman diantaranya: natrium benzoate, vitamin C dan kafien untuk masing-masing
tujuan tertentu. Ketiga zat aditif tersebut merupakan senyawa yang memiliki sifat
kepolaran yang berbeda dan memiliki gugus kromofor yang menyebabkan senyawa
tersebut dapat menyerap sinar UV. Berdasarkan karakteristik senyawa ini
memungkinkan dilakukannya analisis dengan teknik HPLC menggunakan kolom
nonpolar seperti C-18 dan fasa gerak polar.
(Tim Praktikum Kimia Pemisahan, 2020
 Kromatografi merupakan teknik analisis dengan solute atau zat-zat terlarut
terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, karena zat-zat ini melewati kolom
kromatografi.pemisahan solute-solut diatur oleh distribusi solute dalam fase gerak dan
fase diam. Saat ini, HPLC merupakan pemisahan yang diterima secara luas untuk
analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang.
HPLC merupakan metode yang tidak distruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis
kualititaif mapun kuantitatif serta memiliki kecepatan analisis dan kepekaan yang
tinggi.
(Gandjar & Rohman, 2007)
Prinsip kerja HPLC adalah pemisahan setiaap komponen dalam sampel
berdasarkan berdasarkan distribusi differensial komponen di antara dua fasa yang
disebabkan oleh perbedaan kepolaran. Mekanisme kerja HPLC sebagai berikut: dengan
bantuan pompa, fasa gerak cair dialirkan melalui kolom ke detektor. Cuplikan
dimasukan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi
pemisahan komponen – komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi
antara solute – solute terhadap fasa diam. Solute – solute yang kurang kuat interaksinya
dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solute –solute yang
kuat interaksinya dengan fasa diam maka solute –solute tersebut akan keluar dari kolom
lebih lama. Setiap komponen campuran yang keluar kolom dideteksi oleh detector
kemudian direkam dalam bentuk kromatogram.
(Al-Anshory, 2007: 2)

Komponen-komponen penting dari HPLC dapat dilihat pada gambar diagram

balok HPLC berikut ini.
a. Fasa Gerak
Fasa gerak dalam HPLC adalah zat cair. HPLC mempunyai lebih banyak
pilihan fasa gerak. Dalam HPLC, fasa gerak selain berfungsi membawa komponen
– komponen campuran menuju detektor, fasa gerak dapat berinteraksi dengan solute
– solute. Oleh karena itu, fasa gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor
penentu keberhasilan proses pemisahan.
Zat cair yang akan digunakan sebagai fasa gerak HPLC harus memenuhi
beberapa persyaratan berikut:
1. Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang
dianalisis.
2. Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang
dapat mengganggu interpretasi kromatogram.
3. Zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan dalam kolom
4. Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak
beracun
5. Zat cair tidak kental
6. Fasa gerak harus sesuai dengan detektor
Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau fasa gerak adalah
salah satu dari variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi yang
sangat luas pada solven yang digunakan untuk KCKT/HPLC, tetapi ada beberapa
sifat umum yang sangat disukai, yaitu fasa gerak harus :
a. Murni, tidak terdapat kontaminan
b. Tidak bereaksi dengan wadah (packing)
c. Sesuai dengan detektor
 d. Melarutkan sampel
e. Memiliki viskositas rendah
f. Bila diperlukan, memudahkan “sample recovery”
g. Diperdagangan dapat diperoleh dengan harga murah (reasonable price)

b. Pompa (Pump)

Fase gerak dalam HPLC adalah suatu cairan yang bergerak melalui kolom.
Ada dua tipe pompa yang digunakan, yaitu tekanan konstan (constan pressure) dan
pemindahan konstan (constant displacement). Pemindahan konstan dapat dibagi
menjadi dua, yaitu: pompa reciprocating dan pompa syinge. Pompa reciprocating
menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur (pulsating). oleh karena itu,
membutuhkan peredam pulsa atau peredam elektronik untuk menghasilkan garis
dasar (base line) detector yang stabil, bila detector sensitive terhadap aliran.
Keuntungan utamanya ialah ukuran reservoir tidak terbatas. Pompa syrine
memberikan aliran yang tidakberdenyut, tetapi reservoirnya terbatas.

c. Injektor (Injector)
Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan
disturbansi yang minimum dari material kolom. Ada dua model umum :
1. Stopped flow
2. Solvent Flowing
Ada tiga tipe injector yang dapat digunakan:
1. Stop Flow : aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmodfir,
sistemditutup dan alran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena
difusi di dalam cairan kecil resolusi tidak dipengaruhi.
2. Septum : septum yang digunakan pada HPLC sama dengan yang digunakan
pada kromatografi gas. Injector ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60-70
atmosfir, tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut
kromatografi gas. Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum
injector) dapat menyebabkan penyumbatan.
 3. Loop Valve : tipe injector ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volue
lebih besar dari 10μL dan dilakukan dengan cara automatis (dengan
menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksikan
secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi ke dalam loop pada kinerja
atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka sampel akan masuk ke dalam kolom.

d. Kolom (Column)
Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau tidaknya suatu analisis
tergantung pada pemilihan kolom dan kondii percobaan yang sesuai. Kolom dapat
dibagi menjadi dua kelompok:
1. Kolom analitik
Diameter dalam 2-6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis material pengisi
kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang yang digunakan adalah 50-100 cm.
untuk kemasan poros mikropartikulat, 10-30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.
2. Kolom preparative
Umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan panjang kolom 25-100
cm.
Kolom umumnya dibuat dari stainlesteel dan biasanya dioperasikan pada
temperature kamar, tetapi bisa juga digunakan temperature lebih tinggi, terutama
untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Pengepakan kolom
tergantung pada model HPLC yang digunakan (Liquid Solid Chromatography,
LSC; Liquid Liquid Chromatography, LLC; Ion Exchange Chromatography, IEC,
Exclution Chromatography, EC).

e. Detector
Suatu detector dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di
dalam kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadarnya (analisis kuantitatif).
Detector yang baik memiliki sensitivitas yang tinggi, gangguan (noise) yang
rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi respons untuk semua tipe
senyawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran dan fluktuasi temperature
sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh.
 Detector HPLC yang umum digunakan adalah detector UV 254 nm.
Variabelpanjang gelombang dapat digunakan untuk mendeteksi banyak senyawa
dengan range yang lebih luas. Detector indeks refraksi juga digunakan secara luas,
terutama pada kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitive jika
dibandingkan dengan detector UV. Detector-detektor lainnya antara lain:
1. Detector Fluorometer – Detektor spektrofotometer Massa
2. Detektor Ionisasi nyala – Detektor Refraksi Indeks
3. Detektor Elektrokimia – Detektor Reaksi Kimia

f. Elusi Gradien
Elusi gradie didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fasa gerak selama
analisis kromatografi belangsung. Efek dari elusi gradient adalah mempersingkat
waktu retensi dari senyawa-senyawa yang tertahan kuat pada kolom.
Elusi gradient menawarkan beberapa keuntungan:
1. Total waktu analisis dapat direduksi
2. Resolusi persatuan waktu setiap senyawa dalam campuran bertambah
3. Ketajaman peak bertambah (menghilangkan tailing)
Kelebihan HPLC
Kromatografi cair kinerja tinggi atau High performance Liquid Chromatography
(HPLC) merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia. HPLC termasuk metode
analysis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fase gerak cairan dan fase diam
cairan atau padat. Banyak kelebihan dari metode ini jika dibandingkan dengan metode
lainnya. Kelebihan itu antara lain:
1. Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran
2. Mudah melaksanakannya
3. Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi
4. Dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang dianalisis.
5. Resolusi yang baik.
6. Dapat digunakan bermacam-macam detector.
7. Kolom dapat digunakan kembali.
8. Mudah melakukan sample recovery.
 (Effendy, 2004)

Gambar 2. Struktur molekul kafein

Kafein mudah larut dalam pirol, tetrahidrofuran, air, larut dalam etil asetat.
Kenaikan dalam air meningkat dengan alkali benzoate, sinamat, sitrat atau salisilat.
Kafein memiliki pKa 10,4 dan titik didih 234c, bentuknya serbuk atau hablur bentuk
jarum mengkilat biasanya menggumpal, putih, tidak berbau, rasa pahit.
(Moffat & Widdop, 2011)
Kafein bersifat higroskopis, larutan dalam air (1,12 mg/mL) stabil selama tiga
minggu pada 41℉ jika terlindung dari cahaya. Dalam pencahayaan ruangan normal dan
pada suhu kamar, stabil selama 3 hari. Kelarutan kafein dalam air, DMSO, etanol 95%
atau aseton stabil selama 24 jam di bawah kondisi laboratorium normal. Kafein dapat
bereaksi dengan zat pengoksidaasi kuat.
(Chemicalbookk, 2014)

C. Alat-alat yang digunakan

a. Alat
 Perangkat HPLC 1 Set
 Spatula 1 buah
 Labu ukur 50 mL dan 10 mL 6 buah
 Neraca analitik terkalibrasi 1 Set
 Corong pendek 1 buah
 Pipet tetes 6 buah
 Gelas kimia 20 mL 1 buah
 Gelas ukur 500 mL 1 buah
 Ultrasonic vibrator 1 Set
  Pipet seukuran (1, 2, 3, 4, dan 5 mL) 5 buah
 Kertas saring whattman 1 lembar
 Membrane PTFE dan selulosa nitrat 1 lembar
 Botol vial bertutup 5 buah
 Label secukupnya

b. Bahan
 Natrium benzoate p.a 40 mg
 Vitamin C standar 20 mg
 Kafein 10 mg
 Methanol 20 mg
 Methanol for HPLC
 Sampel minuman yang mengandung vitamin C
 Kalium dihidrogenfosfat
 Aquabides
 Asetonitril

D. Langkah Kerja dan Pengamatan

No Langkah Kerja
1 Pembuatan fasa gerak (pelarut)
Larutan fasa gerak KH2PO4
˗ Dihitung jumlah KH2PO4 yang diperlukan untuk membuat larutan KH2PO4
0,01 M sebanyak 500 mL dalam akuades. Kemudian ‘ajust’ pH pada nilai
2,65 dengan asam fosfat.
˗ Larutan KH2PO4 disaring menggunakan membrane selulosa nitrat
˗ Disaring pula untuk asetonitril dengan PTFE
˗ Gelembung dihilangkan pada larutan dengan ultrasonic vibrator selama 15
menit.
˗ Dibuat campuran fasa gerak KH2PO4 dan asetonitril (60:40) untuk
 keperluan larutan standard an larutan sampel, sesuai kebutuhan.

2 Pembuatan larutan induk natrium benzoate, Vit. C dan kafein

Larutan induk
˗ Zat standar ditimbang yaitu sebesar natrium benzoate 20 mg, vit C 20 mg
dan kafein 20 mg
˗ Dicampurkan ketiga zat standar dengan dilarutkan dalam 50 mL fasa gerak
secara kuantitatif pada labu ukur.
˗ Dihomogenkan selama 5 menit menggunakan ultrasonic vibrator
3 Pembuatan deret larutan standar natrium benzoat, Vit C dan kafein.
Deret Larutan standar

˗ Larutan induk dipipet masing-masing 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL dan 5 mL.

diencerkan dengan fasa gerak dalam labu ukur 10 mL
˗ Lartan dihomogenkan, kemudian semua larutan standar disaring dengan
menggunakan membran PTFE
˗ Hasil saringan ditempatkan ke dalam botol vial bertutup yang telah diberi
label
˗ Dilakukan degassing selama 5 menit. Larutan sampel siap diinjeksikan
4 Pembuatan larutan sampel
Larutan sampel
˗ Dipipet 5 mL larutan sampel lalu dilarutkan dengan fasa gerak hingga 10
mL secara kuantitatif pada labu ukur.
˗ Dilakukan penyaringan dengan PTFE, ditampung dalam botol vial tertutup.
˗ Dihilangkan gelembung yang terdaat pada larutan sampel dengan
menggunakan uktrasonic vibrator selama 5 menit.
5 Penyiapan instrument HPLC

Alat HPLC
˗ Alat HPLC dikondisikan dengan :
Fasa gerak dengan sistem elusi gradient dengan kondisi :
 Kolom : C-18 (12,5 cm)
Panjang gelombang : 254 nm
Laju alir : 0,75 mL/menit
Volume injeksi : 20μL
˗ Kabel penghubung listrik dipastikna telah tersambung dengan benar
˗ Ditekan tombol ON pada saklar listrik
˗ Diisi botol fasa gerak dengan volume yang memadai dan botol penampung
dikosongkan
˗ Ditekan tombol On pada alat, berturut-turut untuk power, detector dan
pompa.
˗ Lakukan pemrograman alat dengan computer. Diikuti langkahnya sesuai
instruksi dalam computer
˗ Dipilih mode yang akan digunakan sesuai dengan parameter kondisi
instrument
˗ Apabila kromatogram telah menunjukkan baseline yang mendatar, maka
instrument siap digunakan
˗ Diinjeksi berturut-turut larutan standarnya(mulai dari konsentrasi terendah)
dan terakhir larutan sampel.
˗ Hasil pengukuran dicetak, dan kondisi percobaannya dicatat.
˗ Setelah selesai digunakan, pompa dimatikan dengan menyoroti tanda
pompa dalam computer
 ˗ File ditutup sesuai petunjuk lalu computer dimatikan
˗ Untuk mematikan, tekan tombol off pada pompa, detector dan power
secara berurutan. Lalu sambungan listrik diputuskan.
6 Perhitungan hasil analisis

E. Perhitungan
 Pembuatan larutan KH2PO4
massa 1000
M= x
Mm V ( mL)
M x Mm x V ( mL)
Massa K2PO4 ¿
1000
g
0,01 M x 136 x 1000 ml
Massa K2PO4 mol 1,36 g
¿ =¿
1000
 Pembuatan larutan induk (ppm)
massa lar . induk ( mg)
larutan induk =
volume( L)
a. Natrium Benzoat
20 mg
Natrium Benzoat ¿
0,05 L
mg
NatriumBenzoat ¿ 400 atau 400 ppm
L
b. Kafein
20 mg
Kafein ¿
0,05 L
mg
Kafein ¿ 400 atau 400 ppm
L
c. Vit C
20 mg
Vitamin C ¿
0,05 L
mg
Vitamin C¿ 400 atau 400 ppm
L
 Data grafik atau kurva kalibrasi
y = mx + c
F. Daftar Pustaka
Al-Anshory. 2007. Diktat Pelatihan HPLC. Bandung: Universitas Padjajaran
Chemicalbook. 2014. Caffein. [online]. Tersedia :
https://www.chemicalbook.com/ChemicalProduct.htm., Hal 1 (Diakses pada 28
November 2020)
Gandjar, I. G dan Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka
Belajar
Moffat, A. C & Widdop B. 2011. Clarke’s Analysis of Drugs and Poisons in
Pharmaceuticals, Body Fluids and Postmortem Material, Fourth Edition.
London : Pharmaceutical Press
Putra, Effendy. D. L. 2004. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dalam Bidang Farmasi.
Medan : Jurusan Farmasi Fakultas dan Ilmu Pengetahuan Alam Universias
Sumatera Utara.
Tim Praktikum Kimia Pemisahan. 2020. Penuntun Praktikum Kimia Analitik Instrumen.
Bandung : Departemen Pendidikan Kimia FPMIPA Universitas Pendidikan
Indonesia.