A.

JUDUL : HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

B. TUJUAN :
1. Mahasiswa mampu mengetahui dan memahami prinsip kerja HPLC
2. Mahasiswa mampu mengetahui dan memahami fungsi HPLC
3. Mahasiswa mampu mengetahui dan memahami Jenis HPLC
4. Mahasiswa mampu mengetahui dan memahami bagian-bagian HPLC
5. Mahasiswa mampu mengetahui dan memahami cara menggunakan HPLC
6. Mahasiswa mampu mengetahui dan memahami cara merawat HPLC
7. Mahasiswa mampu mengetahui kelebihan dan kekurangan HPLC

C. DASAR TEORI :
HPLC (High Performance Liquid Chromatography) adalah salah satu teknik
kromatografi cair yang paling banyak digunakan dalam analisis kimia modern. Teknik
ini memungkinkan pemisahan, identifikasi, dan kuantifikasi senyawa dalam campuran
yang kompleks dengan sensitivitas yang tinggi dan waktu analisis yang relatif cepat.
Campuran dipisahkan menggunakan prinsip dasar kromatografi kolom dan kemudian di
identifikasi dan diukur dengan spektroskopi. Dalam HPLC, sampel cair disuntikkan ke
dalam kolom yang dikemas dengan partikel kecil yang disebut fase diam. Kolom
kemudian dihubungkan ke pompa bertekanan tinggi yang mendorong fase gerak
(biasanya pelarut) melalui kolom. Saat fase gerak mengalir melalui kolom, komponen
sampel yang berbeda berinteraksi dengan fase diam dalam berbagai derajat,
menyebabkannya terpisah dan terelusi pada waktu yang berbeda. Komponen yang
dipisahkan dideteksi oleh detektor dan data dianalisis oleh komputer untuk menghasilkan
kromatogram, yang merupakan representasi grafis dari proses pemisahan. Dengan
membandingkan waktu retensi puncak dalam kromatogram dengan standar yang
diketahui, masing-masing komponen dapat diidentifikasi dan diukur. HPLC telah
menjadi teknik yang sangat penting dalam berbagai bidang ilmu seperti farmasi, ilmu
pangan, bioteknologi, kimia lingkungan, dan ilmu forensik.

D. ALAT : HPLC
E. HASIL :

F. PEMBAHASAN :
1. PENGERTIAN HPLC
(High Performance Liquid Chromatography) adalah teknik analisis yang
digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi atau mengukur setiap komponen
dalam suatu campuran. Campuran dipisahkan menggunakan prinsip dasar
kromatografi kolom dan kemudian di identifikasi dan diukur dengan spektroskopi.
HPLC ini lebih dikenal sebagai Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Kromatografi cair
kinerja tinggi (KCKT) adalah teknik pemisahan yang paling banyak digunakan. Ini
bisa sangat sensitif, spesifik, dan tepat. Michael Tswett (1872-1920) dikenal sebagai
bapak kromatografi karena demonstrasinya tentang kromatografi cair. Pada tahun
1903, beliau memisahkan pigmen daun hijau menjadi pita warna. Setelah itu, pada
tahun 1937 – 1938, digunakan kromatografi lapis tipis (KLT). Kemajuan signifikan
berikutnya adalah penggunaan kromatografi kertas pada pertengahan 1940-an.
Kromatografi lapis tipis (KLT) terus berkembang perlahan selama beberapa
tahun berikutnya, tetapi Egon Stahl membuat perkembangan yang signifikan pada
tahun 1956. Egon Stahl menstandarisasi persiapan sorben yang digunakan untuk
membuat pelat. Kromatografi cair tekanan tinggi (HPLC) kemudian dikembangkan
pada tahun 1970-an. Istilah kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) diperkenalkan
pada 1970-an untuk membedakan teknik kinerja tinggi modern dari kromatografi
kolom tekanan rendah klasik, yang dikembangkan pada 1930-an.

2. PRINSIP KERJA HPLC

Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) melibatkan injeksi volume kecil
sampel cair ke dalam tabung yang dikemas dengan partikel kecil (diameter 3 hingga
5 mikron (µm) yang disebut fase diam) di mana komponen individu sampel
dipindahkan
 ke bawah. tabung yang dikemas dengan cairan (fase gerak) yang dipaksa melalui
kolom dengan tekanan tinggi yang dikirim melalui pompa. Pengepakan kolom
digunakan untuk memisahkan komponen satu sama lain. Ini melibatkan berbagai
interaksi kimia dan fisika antara molekul mereka dan partikel pengepakan.
Komponen yang dipisahkan kemudian dideteksi di pintu keluar kolom oleh detektor
yang mengukur jumlahnya. Keluaran dari detektor ini disebut “kromatogram cair”.

3. FUNGSI HPLC
HPLC telah berkembang menjadi metode yang dapat diterapkan secara universal
sehingga dapat digunakan hampir semua bidang kimia, biokimia, dan farmasi.
Berikut ini :

a. Aplikasi Farmasi
1. Untuk mengontrol stabilitas obat
2. Studi pembubaran tablet bentuk sediaan farmasi
3. Kontrol kualitas farmasi

b. Aplikasi Lingkungan
1. Deteksi senyawa fenolik dalam air minum
2. Bio-monitoring polutan

c. Aplikasi dalam Forensik

1. Kuantifikasi obat dalam sampel biologis
2. Identifikasi steroid dalam darah dan urin

d. Analisis Forensik Pewarna Tekstil

1. Penentuan kokain dan obat-obatan lain yang disalahgunakan dalam darah
dan urin
2. Makanan dan rasa
3. Pengukuran Kualitas minuman ringan dan air
4. Analisis gula dalam jus buah
5. Analisis senyawa polisiklik dalam sayuran serta pengawet
 e. Aplikasi dalam Uji Klinis
1. Analisis urin, analisis antibiotik dalam darah
2. Analisis bilirubin, biliverdin pada gangguan hati
3. Deteksi Neuropeptida endogen dalam cairan ekstraseluler otak

4. JENIS-JENIS HPLC
a. Normal Phase HPLC : Jenis HPLC ini juga dikenal sebagai fase normal atau
kromatografi absorpsi. Metode ini memisahkan analit berdasarkan polaritas.
Selain itu, jenis ini juga memiliki fase diam polar dan fase gerak non-polar.
Oleh karena itu, fase diam biasanya silika, dan fase gerak yang khas adalah
heksana, metilen klorida, kloroform, dietil eter, dan campuran. Teknik ini
digunakan untuk senyawa yang peka terhadap air, isomer geometri, isomer
cis-trans, pemisahan kelas, dan senyawa kiral.
b. Reverse Phase HPLC : Fase diam bersifat nonpolar (hidrofobik), sedangkan
fase geraknya bersifat berair, polar sedang. Jenis HPLC ini bekerja
berdasarkan prinsip interaksi hidrofobik maka semakin nonpolar bahan
tersebut, semakin lama akan dipertahankan. Teknik yang digunakan untuk
molekul non-polar, polar, terionisasi, dan ionik.
c. Size exclusion HPLC : HPLC ini juga dikenal sebagai kromatografi permeasi
gel atau kromatografi filtrasi gel. Kolom diisi dengan bahan yang memiliki
ukuran pori yang dikontrol dengan tepat, dan partikel dipisahkan menurut
ukuran molekulnya. Molekul yang lebih besar dengan cepat dicuci melalui
kolom, molekul yang lebih kecil menembus partikel pengepakan berpori dan
terelusi kemudian. Kromatografi eksklusi ukuran juga membantu dalam
menentukan struktur tersier dan kuaterner protein dan asam amino. Hal ini
juga digunakan untuk penentuan berat molekul polisakarida.
d. Ion-Exchange HPLC : Dalam jenis kromatografi ini, retensi didasarkan pada
daya tarik antara ion terlarut dan situs bermuatan yang terikat pada fase diam.
Teknik ini digunakan dalam pemurnian air, kromatografi ligan dan pertukaran
ion protein, kromatografi penukar anion pH tinggi dari karbohidrat dan
oligosakarida.
e. Bio-affinity HPLC : Dalam kromatografi jenis ini, pemisahan didasarkan pada
interaksi reversibel protein dengan ligan.
5. BAGIAN-BAGIAN HPLC
a. Solvent Reservoir : Pada bagian ini terdapat fase gerak atau pelarut. Biasanya
merupakan campuran komponen cair polar dan non-polar yang konsentrasinya
bervariasi tergantung pada komposisi sampel.
b. Pump : Sebuah pompa mengaspirasi fase gerak dari reservoir pelarut dan
memaksanya melalui kolom sistem dan detektor. Tergantung pada beberapa
faktor, termasuk dimensi kolom, ukuran partikel fase diam, laju aliran dan
komposisi fase gerak serta tekanan operasi hingga 42000 kPa (sekitar 6000
psi) dapat dihasilkan.
c. Sample Injector : Sebuah pompa mengaspirasi fase gerak dari reservoir pelarut
dan memaksanya melalui kolom sistem dan detektor. Tergantung pada
beberapa faktor, termasuk dimensi kolom, ukuran partikel fase diam, laju
aliran dan komposisi fase gerak serta tekanan operasi hingga 42000 kPa
(sekitar 6000 psi) dapat dihasilkan.
d. Colums : Kolom pada alat HPLC biasanya terbuat dari baja tahan karat yang
dipoles, panjangnya antara 50 dan 300 mm, dan memiliki diameter dalam
antara 2 dan 5 mm. Mereka biasanya diisi dengan fase diam dengan ukuran
partikel 3- 10 m. Selain itu, terdapat kolom dengan diameter kurang dari 2 mm
sering disebut kolom microbore. Idealnya, suhu fase gerak dan kolom harus
dijaga konstan selama analisis.
e. Detector : Detektor pada HPLC terletak di bagian ujung kolom, mampu
mendeteksi analit yang terelusi dari kolom kromatografi. Pada umumnya,
detektor digunakan adalah spektroskopi UV, fluoresensi, spektrometri massa
dan detektor elektrokimia.
f. Data Collection Devices : Sinyal dari detektor akan dikumpulkan pada
perekam grafik atau integrator elektronik yang bervariasi dalam kompleksitas
dan kemampuannya untuk memproses, menyimpan, dan memproses ulang
data kromatografi. Komputer mengintegrasikan respons detektor ke setiap
komponen dan menempatkannya ke dalam kromatografi yang mudah dibaca
dan dimengerti.
6. CARA MENGGUNAKAN HPLC
a. Pembuatan Kurva Baku
 Siapkan 5 buah labu ukur berukuran 10 mL. Masing masng diberikan
label konsentrasi larutan baku kapsaisin yang akan dibuat 1 ppm, 2 ppm, 5
ppm, 10 ppm, 20 ppm dan 40 ppm.
 Tambahkan larutan baku kapsaisin dengan konsentrasi yang sudah
disediakan ke dalam masing masing labu denga menggunakan metanol
dan air 7:3 hingga tanda batas 10 mL. Lalu masukkan ke dalam masing
masing botol vial.
 Setelah itu, lakukam injeksi pada HPLC dan kromatogram. Simpan dan
jadikan sebagai rekap data.
 Pengukuran ini anda lakukan sebanyak 3 kali. Jangan lupa lakukan juga
perekaman grafik hasil pengukuran menggunakan komputer pada software
yang tersedia dengan panjang gelombang 227 dan 281 nm.
 Selanjutnya, buatlah kurva baku dan dapatkan persamaan garis serta nilai
R2 nya.

b. Preparasi Sample
 Haluskan sampel terlebih dahulu menggunakan mortir hingga menjadi
serbuk halus.
 Timbang sampel sebanyak 1 gram dan masukkan ke dalam tabung
sentrifugasi. Kemudian, tambahkan larutan kloroform sebanyak 8 mL.
 Setelah itu, lakukan sentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm selama 15
menit, setelah itu hasilnya disaring dan dimasukkan ke dalam botol vial.
 Keringkan hingga seluruh kloroform menguap.
 Tambahkan metanol sebanyak 2 mL, lalu sonikasi selama 10 menit.
 Hasil yang diperoleh akan dipindahkan ke dalam tabung eppendorf dan
lakukan sentrifugasi lagi selama 15 menit pada kecepatan 3000 rpm.
 Selanjutnya, ambil hasil sentrifugasi (supernatan) sebanyak 10 µL
menggunakan mikropipet dan campurkan dengan larutan metanol : air
(7:3) sebanyak 990 µL, kemudian dicampurkan menggunakan vortex
mixer.
 c. Pengukuran Konsentrasi Sample
 Siapkan kolom HPLC.
 Masukkan kolom ke wadah sampel pada alat, kemudian nyalakan alat.
 Piih metode analisis dengan waktu selama 10-15 menit.
 Sampel yang di homogenkan dengan vortex mixer kemudian di injeksikan
ke dalam HPLC dan ukur absorbansinya dengan panjang gelombang 227
nm dan 281 nm.
 Kemudian akan menghasilkan kromatogram yang dianalisis sehingga
dapat menemukan konsentrasi kapsaisin dalam sampel.

7. CARA MERAWAT HPLC

Perawatan yang dilakukan pada alat laboratorium merupakan hal yag sangat penting
dilakukan untuk mencegah terjadinya kerusakan pada alat tersebut. Pada alat HPLC,
terutama bagian kolomnya memiliki masa pakai yang terbatas. Sebaiknya, anda
secara rutin memantau karakteristik dan kinerja retensi kolom menggunakan standar.
Jika anda ingin menyimpan kolom untuk jangka waktu yang lama, maka gunakanlah
fase gerak (yang mengandung natrium azida atau konsentrasi metanol dan asetonitril
yang tinggi) untuk menghambat pertumbuhan mikroba.

Selain itu, ada beberapa cara yang dilakukan untuk merawat HPLC, antara lain :

 Pantau bagian kolom secara rutin.

 Hindari pengendapan garam di bagian kolom.
 Gunakan fase gerak yang di saring dan hilangkan gas nya.
 Sebaiknya jangan biarkan kolom mengering. Harus tetap tertutup rapat saat
tidak digunakan.
 Untuk penyimpanan yang lama, gunakan fase gerak yang menghambat
pertumbuhan bakteri dan jamur.
 Gunakan kolom ke arah yang ditunjukkan pada label. Tekanan operasi yang
sangat tinggi dapat menunjukkan frit saluran masuk yang tersumbat dan dapat
dibersihkan dengan aliran balik melalui kolom selama 10-20 mL.
 Gunakan kolom pelindung Hamilton untuk menghilangkan partikel atau kotoran
yang mungkin secara permanen mengikat kolom analitik.
8. KELEBIHAN DAN KEKURANGAN HPLC
a. Kelebihan HPLC
Penggunaan HPLC sangat luas. Bahkan, HPLC menjadi alat yang sudah
familiar dan tidak asing lagi di dalam laboratorium. Selain itu, HPLC juga bisa
diaplikasikan dalam berbagai bidang seperti farmasi, kimia, forensik dan
masih banyak lagi. Berikut ini beberapa kelebihan dari HPLC, antara lain :

1. Cepat, efisien dan akurat

Dibandingkan dengan teknik kromatografi lainnya seperti KLT, HPLC
ini sangat cepat dan efisien. HPLC menggunakan pompa untuk
memaksa pelarit cair masuk melalui bahan penyerap yang padat,
dengan kompinen kimia yang berbeda dapat memisahkan bahan
tersebut saat bergerak pada kecepatan berbeda. Nah, proses ini dapat
diselesaikan hanya dalam waktu 10-30 menit di HPLC serta mampu
memberikan resolusi yang tinggi. Tentu saja hal ini sangat akurat.

2. Sensitivitas dan Resolusi

Secara umum, HPLC sangat tepat digunakan dalam hal yang
mengidentifikasi dan mengukur suatu komponen kimia. Dengan
banyak langkah yang digunakan, ketepatan HPLC sebagian besar
bergantung pada proses yang otomatis. HPLC memang memiliki
sensitivitas yang rendah untuk senyawa tertentu dan ada beberapa yang
tidak terdeteksi karena sudah teradsorpsi secara irreversible.

b. Kekurangan HPLC
1. Kolusi
Karena kecepatan HPLC dan ketergantungan pada polaritas senyaawa
yang berbeda, dua senyawa dengan struktur dan polaritas yang sama
dapat keluar dari perlatan kromatografi pada waktu yang sama. Hal ini
dikenal sebagai “kolusi”.

2. Senyawa yang diserap

HPLC biasanya menggunakan kolom kaca yang diisi dengan manik
manik yang terbuat dari bahan yang berbeda. Campuran dipaksa
melalui
 kolom bahan kimia yang mengikat engan kekuatan berbeda untuk
manik manik. Kekuatan pengikatan, yang tergantung pada kesamaan
polaritas, menentukan berapa lama bahan kimia akan mengikat manik-
manik sebelum dilepaskan. Beberapa senyawa terikat sangat kuat
sehingga pada dasarnya tidak pernah dilepaskan dari butiran di kolom
dan tidak pernah diukur dalam larutan yang keluar dari kolom.

3. Biaya
Teknik pemisahan laboratorium yang umum melibatkan
pengembangan pengujian untuk memisahkan senyawa individu dari
larutan. Namun, ini juga biasanya menghasilkan beberapa solusi yang
juga perlu menjalani prosedur, yang mengarah pada peningkatan
kompleksitas yang eksponensial. Meskipun HPLC seringkali mampu
menyederhanakan dan mempercepat proses ini, biaya
pengembangan peralatan HPLC sangatlah besar. Meskipun lebih
efisien, mengembangkan HPLC jauh lebih mahal daripada
mengembangkan pengujian lain untuk memisahkan senyawa. Hal ini
membuat HPLC menjadi tidak layak secara finansial untuk banyak
laboratorium kecil di lembaga swasta.

4. Kompleksitas
Tidak hanya dgunakan untuk memisahkan senyawa sederhana saja,
tetapi HPLC juga digunakan untuk mengisolasi protein tertentu dari
campuran seluler. Dalam hal ini, manik manik di kolom biasanya
dilapisi dengan antibodi khusus untuk protein yang perlu dikumpulkan.
Tentu saja hal ini membutuhkan teknisi yang sangat terampil untuk
memantau kolom setiap saat dan memastikan bahwa prosesnya
berjalan sesuai dengan rencana.

G. KESIMPULAN :
(High Performance Liquid Chromatography) adalah teknik analisis yang digunakan
untuk memisahkan, mengidentifikasi atau mengukur setiap komponen dalam suatu
campuran. Campuran dipisahkan menggunakan prinsip dasar kromatografi kolom dan
kemudian di identifikasi dan diukur dengan spektroskopi. Prinsip dasar HPLC (High
Performance Liquid Chromatografi) adalah pemisahan senyawa-senyawa berdasarkan
 kepolaran, dimana terdapat fase mobile (gerak) dan fase stasioner (diam). Fase
mobilenya adalah sampel dan eluen yang bercampur, dan fase stasionernya adalah silika
gel yang mengandung hidrokarbon. Sehingga senyawa yang memiliki kepolaran yang
lebih tinggi akan tertahan pada fase stasioner yang bersifat polar. HPLC sering
digunakan antara lain untuk menetapkan kadar senyawa aktif pada obat, produk hasil
samping proses sintesis, atau produk- produk degradasi dalam sediaan farmasi.
Contohnya adalah menganalisis parasetamol dan kafein dalam suatu campuran.

H. DAFTAR PUSTAKA :
Murningsih, T., & Chairul. (2000). Mengenal Hplc: Peranannya Dalam Analisa Dan
Proses Isolasi Bahan Kimia Alam. Berita Biologi, 5(2), 261–272.

PT. Andaru Analitika Sains. (2022, Juni 23). HPLC – Pengertian, Fungsi, Prinsip dan
Penggunaannya. Retrieved from Andaru Analitika Sains Solusi Kebutuhan Alat
Laboratorium Analitika Sains: https://analitika.co.id/hplc/