NAMA : Dzulkifli Florenda Metiardo

NIM : 171810301021

TUGAS REVIEW KROMATOGRAFI

(HLPC / High Performance Liquid Chromatography)

HPLC / High Performance Liquid Chromatography adalah suatu jenis kromatografi yang
memiliki kemampuan untuk mengidentifikasi, memisahkan, dan mengkuantifikasi senyawa -
senyawa yang berada dalam sampel apapun yang dapat dilarutkan dalam cairan.
HPLC (High Performance Liquid Chromatography) termasuk dalam metode analisis yang sangat
akurat dan secara luas digunakan secara kualitatif maupun kuantitatif dalam produksi obat-
obatan.

Beberapa keuntungan dari HPLC (High Performance Liquid Chromatography) yaitu

analisisnya simultan, resolusi dan sensitivitasnya tinggi, pengulangannya baik, ukuran sampel
yang digunakan kecil, kondisi analisis sedang, mudah untuk fraksinasi sampel dan pemurnian.

o Senyawa sampel dengan afinitas yang lebih tinggi pada lapisan stationary akan berpindah
lebih lambat dan dan untuk jaraknya lebih pendek dibandingkan pada senyawa yang
memiliki sedikit afinitas akan berpindah lebih cepat dan jarak yang lebih panjang.
o Prinsipnya yaitu larutan sampel diinjeksikan atau disuntikkan ke dalam kolom material
berpori (fasa diam) dan cairan (fasa gerak) dipompa dengan tekanan tinggi melewati kolom.
Pemisahan sampel berdasarkan perbedaan laju migrasi melewati kolom keluar dari
perbedaan partisi sampel antara fasa stationary dan fasa mobile. Tergantung perbedaan
partisi dari tiap komponen, elusi pada waktu yang berbeda.
o HPLC / High Performance Liquid Chromatography memiliki kinerja yang lebih fleksibel
dibandingkan kromatografi gas, hal ini dikarenakan pada HPLC (High Performance Liquid
Chromatography) tidak terbatas terhadap sampel yang mudah menguap dan stabil secara
termal, serta fasa diam dan fasa geraknya lebih luas.
HPLC diklasifikasikan diantara sebagai berikut:

o Berdasarkan skala operasi, berdasarkan prinsip pemisahan, berdasarkan teknik elusi,

berdasarkan mode operasi.
 Berdasarkan skala operasi yaitu HPLC preparatif dan HPLC analisis
 Berdasarkan prinsip pemisahan yaitu kromatografi afinitas, kromatografi adsorpsi,
kromatografi pengecualian ukuran, kromatografi penukar ion dan kromatografi
fase kiral
 Berdasarkan teknik elusi yaitu pemisahan gradien, dan pemisahan isokratik
 Berdasarkan mode operasi yaitu kromatografi fasa normal dan kromatografi fasa
balik

Kromatografi fasa balik (RP-HPLC) adalah jenis kromatografi yang memiliki fasa diam yang
merupakan fasa nonpolar sedangkan fasa geraknya adalah fasa polar atau sedang.

Prinsip RP-HPLC didasarkan pada prinsip interaksi hidrofobik. Pada campuran yang
analitnya relatif kurang polar akan dipertahankan oleh fasa diam yang nonpolar lebih lama
dibandingkan yang relatif lebih polar. Oleh karena itu, komponen yang paling polar akan dielusi
terlebih dahulu.

Kromatografi fasa normal adalah kromatografi yang fasa geraknya merupakan fasa nonpolar
sedangkan fasa diamnya merupakan fasa polar. Prinsip daari kromatografi fasa normal adalah
polaritas yang meningkat pada solute akan meningkatkan kapasitas adsorpsi yang mengarah ke
peningkatan waktu elusi. Kromatografi ini menggunakan silika yang dimodifikasi secara kimia
(cyanopropyl, aminopropyl, dan diol) sebagai fasa diam.

Contohnya yaitu misalkan dalam suatu kolom senyawa polar dalam campuran yang
dilewatkan akan menempel lebih lama ke silika polar lebih lama dibandingkan dengan senyawa
nonpolar sehingga fasa nonpolar akan melewati kolom dengan cepat.
Komponen validasi metode, karakteristik khas yang dapat diuji selama validasi metode :

1. Akurasi, kedekatan nilai yang diukur dengan nilai sebenarnya

2. Presisi, menunjukkan ukuran reproduktifitas dari seluruh metode analisis
3. Linearitas, yakni kemampuan prosedur analisis untuk memperoleh respon yang
sebanding dengan jumlah analit dalam sampel
4. Limit deteksi dan kuantifikasi. LOD (limit deteksi) menyatakan jumlah analit
terendah dalam sampel yang dapat dideteksi. LOQ (limit kuatifikasi) menyatakan
jumlah analit terendah dalam sampel yang ditentukan secara presisi dan akurasi
5. Spesifisitas, kemampuan menentukan analit dengan tepat terhadap komponen
yang mungkin ada
6. Range, menyatkan interval antara tingkat analit tetinggi dan terendah yang telah
ditentukan secara presisi, akurasi dan linearitas.

Langkah yang terlibat dalam pengembangan metode HPLC yakni sebagai berikut ;

1. Mengetahui sifat fisikokimia dari molekul obat, sifat fisikokimia ini meliputi
kelarutan, polaritas, pKa, dan pH molekul obat. Polaritas membantu dalam
pemlihan pelarut dan komposisi fasa gerak. Kelarutan dapat dijelakan melalui
polaritas molekul, hal ini memperhatikan pemilihan fasa atau pelarut fasa gerak
yang berdasarkan kelarutan analit. Nilai pH dan pKa diperlukan untuk analisis
ioniik yang mengarah ke puncak simetris dalam HPLC secara kuantitatif.
2. Pemilihan kondisi kromatografi, seperti kondisi kolom yakni harus stabil,
memiliki kinerja tinggi, serta menghindari retensi sampel. Pemilihan buffer juga
diatur oleh pH yang diinginkan, yang mana tipe pH untuk fasa terbalik pada silika
yakni pH 2 sampai 8. Buffer harus memiliki nilai pKa yang dekat dengan pH
karena buffer mengontrol pKa dan pH. Dengan aturan pada buffer, nilai pKa<2
terhadap pH fasa gerak. Diameter internal pada kolom HPLC berpengaruh
terhadap sensitivitas, selektivitas dalam pemisahan serta menentukan jumlah
analit yang dapat masuk ke kolom. Ukuran partikel yang kecil memberikan luas
permukaan yang banyak sehingga pemisahan makin baik namun tekanan yang
diperlukan meningkat. ukuran pori kolom menentukan kemampuan molekul analit
untuk menembus dan berinteraksi dengan permukaan bagian dalam. Memilih fasa
 gerak beperan penting dalam resolusi, selektivitas dan efisiensi. Pemilihan yang
terakhir dari kondisi kromatografi adalah memilih detector hal ini karena
bergantung pada analisis sifat kimia, potensial interferensi, limit deteksi, dan
biaya pendeteksi
3. Pengembangan pendekatan analisis. Dalam hal ini yang perlu dikembangkan
yakni parameter kromatografi seperti pemilihan fasa gerak, pemilihan kolom,
pemilihan laju aliran fasa gerak. Parameter tersebut mempertimbangkan
parameter umum seperti waktu retensi
4. Preparasi sampel. Hal ini agar alikuot bebas dari gangguan, tidak merusak kolom,
kompatibel dengan metode HPLC yakni pelarut dapat larut dalam fasa gerak
tanpa mempengaruhi retensi atau resolusi sampel.
5. Metode optimasi, yakni identifikasi kelemahan metode dioptimalkan melalui
desain ekspreimental dimana memahami kinerja metode dengan kondisi berbeda,
pengaturan instrumen, dan sampel yang berbeda.
6. Validasi metode, merupakan suatu proses evaluasi kinerja metode dan
menunjukkan bahwa itu memenuhi persyaratan tertentu.
- Tipe Prosedur Analisis untuk divalidasi yakni dapat diarahkan ke empat jenis
prosedur analitis paling umum meliputi; uji identifikasi, uji kuatifikasi untuk
kandungan pengotor, uji batasan untuk mengontrol pengotor, uji kuantifikasi
bagian aktif sampel bahan obat yang dipilih dalam produk obat.