HPLC

APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN KADAR
SEDIAAAN OBAT
BAB 1 PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang

Analisis instrumen dikenal sebagai analisis fisika kimia, sebab
instrument yang digunakan dalam penentuan sampel didasarkan pada
sifat-sifat fisika-kimia dari molekul atau atom dalam sampel yang
dianalisis. Analisis kualitatif bertujuan untuk mengetahui keberadaan
suatu unsur atau senyawa kimia, baik organic maupun inorganic.
Sedangkan analisis kuantitatif bertujuan untuk mesngetahui jumlah suatu
unsur atau senyawa dalam suatu cuplikan.
Penetapan kadar suatu senyawa dalam sediaan berguna untuk
mengetahui persen kadar yang baik senyawa tersebut dalam sediaan ,
dan kadarnya sesuai dengan yang tertera dalam literature
Pada praktikum ini untuk menetapkan kadar suatu senyawa yaitu
dengan menggunakan metode HPLC) (High Performanced Liquid
chromatoghraphy) atau KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi) metode
ini menggunakan prinsip metode pemisahan suatu senyawa yang
terdapat dalam suatu sampel berdasarkan tingkat kepolarannya, HPLC
digunakan khususnya untuk bahan yang non-volatile (tidak mudah
menguap), karena pada alat KCKT ini digunakan tekanan yang tinggi,
dalam HPLC dapat digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif,
untuk analisis kualitatif hasilnya dapat dilihat dari hasil pembacaan
berupa kromatogram yang menandakan waktu retensi suatu senyawa,
untuk analisis kuantitatif hasilnya dapat dilihat dari hasil pembacaan
berupa kromatogram yang menunjukkan luas area
Dalam praktikum kali ini digunakan beberapa obat untuk ditentukan
kandungan suatu senyawa dan kadar senyawa tersebut dengan
menggunakan metode HPLC, HPLC memudahkan dalam analisis
kualitatif dan kuantitaif karena hasilnya langsung terbaca dengan melihat
ZUMRATUL INAYAH ABDILLAH WADJO S.FARM

15020140111
SEDIAAAN OBAT
hasil berupa kromatogram, alasan mengapa dilakukan penetapan kadar

dengan menggunakan metode HPLC yaitu untuk mengetahui jumlah atau
banyaknya atau kadar suatu senyawa yang terdapat pada suatu sediaan,
apakah sudah sesuai dengan yang ada di literature.
1.1 Maksud Praktikum
Adapun maksud percobaan yaitu untuk mengetahui dan
memahami cara penentuan suatu sediaan obat dengan menggunakan
metode kromatografi HPLC.
1.2 Tujuan Praktikum
Adapun tujuan dari percobaan ini yaitu menganalisa dan
menentukan kadar suatu sediaan obat tablet parasetamol dengan metode
standar eksternal dan krim Miconazol menggunakan metode standar
internal Econazol.

15020140111
SEDIAAAN OBAT
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Teori Umum

High performance liquid chromatography (HPLC) atau yang sering
disebut kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) adalah jenis kromatografi
yang penggunaannya paling luas. Kegunaan umum HPLC adalah untuk
pemisahan dan pemurnian senyawa obat serta untuk analisis kuantitatif
senyawa obat dalam sediaan farmasetika. Disamping itu, HPLC juga
digunakan untuk identifikasi kualitatif senyawa obat berdasarkan pada
parameter waktu retensi senyawa obat standar serta senyawa obat
dalam sampel (Gandjar dan Rohman, 2012).
Kegunaan HPLC antara lain:
- Untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun
senyawa biologis
- Analisis ketidakmurnian (impurities)
- Analisis senyawa-senyawa tidak mudah menguap (non volatile)
- Penentuan molekul-molekul netral, ionik, maupun zwitter ion
- Isolasi dan pemurnian senyawa
- Pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir sama
- Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah yang sekelumit (trace
element), dalam jumlah banyak, dan dalam skala proses industry
(Gandjar dan Rohman, 2007)
Parameter yang dapat digunakan untuk mengetahui kualitas suatu
kromatogram adalah Resolusi (Rs), Faktor Retensi (k), Faktor selektifitas
(α), Efisiensi dan jumlah lempeng teoritis (N).
- Resolusi (Rs)
Hal yang terpenting dari HPLC adalah mengoptimasi resolusi dalam
waktu yang minimum. Nilai resolusi yang melebihi 1,5 diantara dua
puncak akan memberikan nilai pemisahan yang baik. Resolusi

15020140111
SEDIAAAN OBAT
dipengaruhi oleh beberapa parameter diantaranya: Selectivity,

Effieciency, dan Retention.
- Faktor Retensi (k)
Faktor retensi adalah waktu yang diperlukan untuk membawa keluar
suatu komponen dari dalam kolom kromatografi. Nilai k yang tinggi
mengindikasikan sampel memerlukan waktu dalam berinteraksi dengan
fase diam terlebih dahulu hingga keluar dari kolom saat tepat dalam
konsentrasi maksimum.
- Faktor selektifitas (α)
Selektifitas merupakan kemampuan instrumen dalam mengenali
senyawa-senyawa dalam campuran untuk mendapat selektifitas yang
maksimum diperlukan interaksi yang sesuai (partisi, adsorpsi, size
exclusion, atau ion exchange). Apabila kedua senyawa memiliki k atau
nilai α = 1 kedua senyawa tidak dapat dipisahkan. akibat waktu
retensinya identik. Agar terjadi pemisahan yang baik maka nilai
selektivitas (α) harus lebih besar daripada 1, semakin besar nilai α maka
pemisahannya akan semakin baik. Nilai α dapat diubah-ubah dengan
cara, mengubah fasa gerak (misalnya dengan memperbesar polaritas),
mengubah fasa diam, mengubah temperatur karena pada umumnya
kenaikan temperatur akan memperkecil waktu retensi, dan mengubah
bentuk komponen
- Efisiensi
Efisiensi kolom merupakan kemampuan kolom mengeluarkan hasil yang
diinginkan dengan memuaskan dan dalam waktu yang singkat. Hasil
yang idel kolom yang efisien akan menghasilkan puncak yang tajam.
Efisiensi sangat dipengaruhi oleh kapasitas dari kolom.
- Lempeng teoritis (N)

15020140111
SEDIAAAN OBAT
Merupakan parameter yang menghitung efisiensi kromatografi.

Menyatakan jumlah peristiwa partisi yang dialami oleh analit pada setiap
saat yang dibawa oleh fase gerak selama elusi. Dimana semakin besar
harga N akan memberikan puncak yang lebih efisien (Clarke, 2005)
Parasetamol merupakan metabolit fenasetin dengan efek analgetik
ringan sampai sedang, dan antipiretik yang ditimbulkan oleh gugus
aminobenzen, sedangkan kafein adalah basa lemah yang merupakan
turunan xantin, memiliki gugus metil dan berefek stimulasi susunan
saraf pusat serta dapat memperkuat efek analgetik parasetamol. Dilihat
dari strukturnya, parasetamol mempunyai gugus kromofor dan ausokrom,
yang dapat menyerap radiasi, sehingga dapat dilakukan dengan
metode spektrofotometri, tetapi kendala yang sering dijumpai adalah
terjadinya tumpang tindih spektra (overlapping) karena keduanya
memiliki serapan maksimum pada panjang gelombang yang
berdekatan sehingga diperlukan proses pemisahan terlebih dahulu
(Naid, 2011).
Miconazole adalah obat yang aktif secara topical dan jarang
diberikan secara parenteral karena toksisitasnya yang berat. Mekanisme
kerja dan spectrum antifunginya sama dengan ketoconazole.
Penggunaan topical terkait dengan dermatis kontak, iritasi vulva, dan
edema. Miconazole adalah inhibitor metabolism warfarin yang kuat dan
menyebabkan perdarahan pada pasien yang diobati dengan warfarin,
bahkan ketika miconazole diberikan secara topical. Tidak ada perbedaan
yang signifikan dalam hasil klinis yang terkait dengan azole apapun atau
nystatin dengan pengobatan vulva (Harvey, 2013).
Prinsip dasar HPLC adalah fase gerak air dialirkan dengan pompa
melalui kolom ke detektor. Cuplikan dimasukkanke datigum aliran fase
gerak dengan cara penyuntikan. Didalam kolom terjadi pemisahan

15020140111
SEDIAAAN OBAT
komponen-komponen cairan karena perbedaan kekuatan interaksi antara

salut-salut terhadap fase diam akan keluar dari kolom lebih dahulu dan
sebaliknya. Setiap komponen campuran yang keluar dari kolom
dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram
(Lestari, 2014).
Bagian-bagian HPLC yaitu (Ardianingsih, 2010):
a. Eluent yang berfungsi sebagai fase gerak yang akan membawa
sampel tersebut masuk kedalam koloni pemisah.
b. Pompa yang berfungsi untuk mendorong eluen dan sampel tersebut
masuk kedalam kolom, kecepatan alir ini dapat dikontrol dari
perbedaan kecepatan bisa mengakibatkan perbedaan hasil.
c. Injektor, tempat memasukkan sampel dan kemudian sampel dapat
didistribusikan masuk kedalam kolom.
d. Kolom pemisah ion, berfungsi untuk memisahkan ion-ion yang ada
dalam sampel. Ketepatan antara kolom dan eluen bisa memberikan
hasil/puncak yang maksimal, begitupun sebaliknya, jika tidak ada
kecocokan, maka tidak akan memunculkan puncak.
e. Detektor, yang berfungsi membawa ion lemak kedalam detektor.
f. Rekorder data, berfungsi untuk merekam dan mengola data yang
masuk.
Beberapa kelebihan yang dimiliki kromatografi HPLC sehingga
menjadikannya sebagai “the best choice” dalam dunia
penentuan/pemisahan ion/logam, di antaranya (Adrianingsih, 2011) :
a. Kecepatan (speed)
Kecepatan dalam analisis suatu sampel menjadi aspek yang
sangat penting dalam hal analisis ion yaitu untuk mengurangi biaya,
bisa mengahsilkan data analisis yang akurat dan cepat dan bisa
mengurangi limbah (waste) yang dihasilkan dari penggunaan eluen.

15020140111
SEDIAAAN OBAT
b. Sensitivitas (sensitivity)
Perkembangan rehnologi mikro prosessor yang dikombinasikan
dengan efisiensi kolom pemisah, mulai ukuran diameter dalam
milimeter sampai skala mikro yang biasa juga disebut microcolumn,
membuat pendeteksian ion dalam sampel menjadi lebih baik,
meskipun jumlah sampel yang diinjeksikan ke dalam kolom pemisah
sangat sedikit.
c. Selektivitas (selectivity)
Dengan sistem ini, bisa dilakukan pemisahan berdasarkan
keinginan, misalnya kation/anion organik saja atau kation/anion
anorganik yang ingin dipisahkan. Itu dapat dilakukan dengan memilih
kolom pemisah yang tepat.
d. Pendeteksian yang serempak (simultaneous detection)
Teknik pendeteksian sekali injeksi untuk sebuah sampel seperti ini
penting untuk dilakukan karena tentunya mempunyai sejumlah
kelebihan dibanding pemisahan terpisah. Sebagaimana telah diulas
diatas, beberapa kelebihan di antaranya dapat menekan biaya
operasional, memperkecil jumlah limbah saat analisis (short time
analysis) serta dapat memaksimalkan hasil yang diinginkan.
e. Kestabilan pada kolom pemisah (stability of the separator column)
Walaupun sebenarnya, ketahanan kolom ini berdasarkan pada
paking (packing) material yang diidikan ke dalam kolom pemsiah bisa
bertahan pada perubahan yang terjadi pada sampel, misalnya
konsentrasi suatu ion terlalu tinggi, tidak akan mempengaruhi
kestanilan material penyusun kolom pemisah yang mempunyai waktu
penggunaan yang tidak terlalu lama, dikarenakan kemasan kolom
yang kurang baik atau karena faktor internal lainnya.
1.2 Uraian Bahan

15020140111
SEDIAAAN OBAT
1. Asam asetat (Ditjen POM, 1979 : 42)

Nama resmi : ACIDUM ACETICUM GLACIALE
Nama lain : Asam asetat glacial
RM/BM : C2H2O2 / 60,05
Rumus struktur :
Pemerian : Cairan jernih, tidak berwarna, bau khas,
tajam, jika diencerkan dengan air, rasa
asam
Kelarutan : Dapat campur dengan air, dengan etanol
(95%) P dan dengan gliserol P
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup rapat
Kegunaan : Zat tambahan
2. Natrium Asetat (Ditjen POM, 1995 : 709)
Nama resmi : NATRII ACETICUM
Nama lain : Natrium Asetat
RM/BM : CH3COONa/93,52
Pemerian : Serbuk atau massa puith keabuan,
higroskopik.
Kelarutan : Larut baik dalam air.
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik
Kegunaan : Sebagai zat tambahan
3. Parasetamol (Ditjen POM,1979 : 37)
Nama Resmi : ACETAMINOPHEUM
Nama Lain : Asetaminofen, Parasetamol
RM/BM : C8H9NO2/151,16

15020140111
SEDIAAAN OBAT
Rumus Struktur :
Pemerian : Hablur atau serbuk hablur putih; tidak berwarna;

rasa pahit.
Kelarutan : Larut dalam 70 bagian air, dalam 7 bagian
etanol (95%) P, dalam 13 bagian aseton P,
dalam 40 bagian gliderol P, dan dalam 9 bagian
propilenglikol P, larut dalam larutan alkali
hidroksida.
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik, terlindungi dari
cahaya.
Kegunaan : Analgetikum; Antipiretikum
4. Miconazole
Merek dagang : Miconazole, Clearderma, Daktarin, Daktazol,
Fungitia, Funtas, Goderm, Kalpanax-K.
Komposisi : Miconazole nitrat 20 mg
Indikasi : Kulit dan kuku infeksi yang disebabkan oleh
dermatophytes, yeastsnand berbagai jamur
lain, misalnya. tinea capitis, tinea corporis, tinea
manum, tinea pedis.
2.2 Prosedur kerja (Anonim, 2018)
1. Penetapan Kadar Tablet Parasetamol dengan Metode Standar
Eksternal

15020140111
SEDIAAAN OBAT
a. Menggunakan kolom ODS (oktadesisilen,C18) : diameter 4,6 mm

dan panjang 150 mm.
b. Fase gerak : campuran dari asetonitril : asam asetat 0,05 M
(85:15).
c. Kecepatan alir 1 mL/menit
Prosedur :
1. Timbang 125 mg parasetamol baku dimasukkan dalam labu takar
250 mL dan diencerkan dengan larutan asam asetat 0,005 M
sampai tanda batas (larutan stok).
2. Buat seri larutan baku dari larutan stok dengan deret konsentrasi
0,5, 1,0, 1,5, 2,0, dan 2,5 mg/100 mL.
3. Dilakukan penetapan kadar kelima larutan standar diatas dengan
HPLC.
4. Ditimbang berat 20 tablet parasetamol yang dianalisis, adalah
12,1891 gram.
5. Serbuk tablet diambil 150,5 mg dilarutkan dengan asam asetat
0,05 M dalam labu takar 250 mL, lalu disaring.
6. Dipipet 25 mL alikot dan encerkan dengan asam asetat 0,05 M
sampai 100 mL dalam labu takar. Selanjutnya, larutan diencerkan
lebih lanjut dengan mempipet 10 mL ke dalam labu takar 100 mL
dengan larutan asam asetat 0,05 M sampai tanda batas.
7. Larutan, dilakukan penetapan menggunakan kromatografi HPLC
pada kondisi sama pada larutan baku. Adapun hasilnya diperoleh
luas puncak kromatogram = 45.205.
8. Tetapan tablet parasetamol sesuai persyaratan tablet dalam
Farmakope Indonesia.
2. Penetapan Kadar Krim Miconazole dengan Metode Standar
Internal Econazole

15020140111
SEDIAAAN OBAT
a. Menggunakan kolom ODS : diameter 4,6 mm dan panjang 150

mm.
b. Fae gerak : campuran asetonitril : buffer pH 4,0 Na. Asetat 0,1 M
(70:30).
c. Kecepatan alir 1 mL /menit
Prosedur :
1. Buat larutan standar miconazole nitrat dan econazole nitrat
(standar internal) dengan menimbang masing-masing 200,0 mg.
Kemudiaan, masing-masing dilarutkan dengan larutan fase gerak
sampai 250 mL dalam labu takar.
2. Pipet 25 mL larutan econazole stok standar masukkan ke dalam
lima buah labu takar 100 mL. Selanjutnya, pada kelima labu takar
tersebut ditambahkan larutan stok standar miconazole masing-
masing 15 mL, 20 mL, 25 mL, 30 mL, dan 35 mL. Lalu encerkan
dengan larutan fase gerak hingga tanda batas.
3. Kelima deret konsentrasi standar tersebut, masing-masing
dilakukan pengukuran dengan kromatografi HPLC.
4. Sampel krim yang diuji mengandung miconazole nitrat 20 mg
dalam 1000 mg krim (2%). Berat krim miconazole adalah 1,0368 g,
berat krim yang digunakan untuk analisis adalah 201,5 mg.
5. Ditimbang 201,5 mg krim dilarutkan dengan 25 mL larutan fase
gerak dalam corong pisah sambil dikocok selama 5 menit.
Ekstraksi dengan 50 mL heksan dari lapisan heksan
dikeluarkan/dibuang. Larutan fase gerak dialiri gas nitrogen untuk
menghilangkan sisa heksan, setelah itu dimasukkan ke dalam labu
ukur 100 mL dan diencerkan sampai batas dengan larutan fase
gerak. Saring larutan dan pipet sebanyak 20 mL untuk dilakukan

15020140111
SEDIAAAN OBAT
pengukuran kromatografi HPLC mrnggunakan detector pada UV

pada panjang gelombang 220 nm.
6. Hasil pengukuran HPLC diperoleh data, sebagai berikut :
a. Luas puncak kromatografi sampel miconazole = 119.923.
b. Luas puncak kromatografi pembanding econazole = 124.118.
7. Hitung persentase kadar miconazole dalam krim dan tetapkan
persyaratan sediaan krim miconazole yang tertera dalam

15020140111
SEDIAAAN OBAT
BAB 3 METODE KERJA
3.1 Alat Praktikum

Adapun alat yang digunakan dalam praktikum yaitu batang
pengaduk, corong penyaring, detector, erlenmeyer, gelas piala, kertas pH
universal, labu takar 100 dan 250 mL, pipet volum 10 dan 25 mL, sendok
tanduk dan timbangan analitik (Neraca).
3.2 Bahan Praktikum
Adapun bahan yang digunakan dalam praktikum yaitu asam asetat,
econazole, miconazole, natrium asetat, parasetamol dan tissue.
3.3 Cara Kerja
Eksternal
a. Menggunakan kolom ODS (oktadesisilen,C18) : diameter 4,6 mm
dan panjang 150 mm.
b. Fase gerak : campuran dari asetonitril : asam asetat 0,05 M
(85:15).
c. Kecepatan alir 1 mL/menit
Prosedur :
1. Timbang 125 mg parasetamol baku dimasukkan dalam labu takar
250 mL dan diencerkan dengan larutan asam asetat 0,005 M
sampai tanda batas (larutan stok).
2. Buat seri larutan baku dari larutan stok dengan deret konsentrasi
0,5, 1,0, 1,5, 2,0, dan 2,5 mg/100 mL.
3. Dilakukan penetapan kadar kelima larutan standar diatas dengan
HPLC.
4. Ditimbang berat 20 tablet parasetamol yang dianalisis, adalah
12,1891 gram.

15020140111
SEDIAAAN OBAT
5. Serbuk tablet diambil 150,5 mg dilarutkan dengan asam asetat

0,05 M dalam labu takar 250 mL, lalu disaring.
6. Dipipet 25 mL alikot dan encerkan dengan asam asetat 0,05 M
sampai 100 mL dalam labu takar. Selanjutnya, larutan diencerkan
lebih lanjut dengan mempipet 10 mL ke dalam labu takar 100 mL
dengan larutan asam asetat 0,05 M sampai tanda batas.
7. Larutan, dilakukan penetapan menggunakan kromatografi HPLC
pada kondisi sama pada larutan baku. Adapun hasilnya diperoleh
luas puncak kromatogram = 45.205.
8. Tetapan tablet parasetamol sesuai persyaratan tablet dalam
Internal Econazole
a. Menggunakan kolom ODS : diameter 4,6 mm dan panjang 150
mm.
b. Fase gerak : campuran asetonitril : buffer pH 4,0 Na. Asetat 0,1 M
(70:30).
c. Kecepatan alir 1 mL /menit
Prosedur :
1. Buat larutan standar miconazole nitrat dan econazole nitrat
(standar internal) dengan menimbang masing-masing 200,0 mg.
Kemudiaan, masing-masing dilarutkan dengan larutan fase gerak
sampai 250 mL dalam labu takar.
2. Pipet 25 mL larutan econazole stok standar masukkan ke dalam
lima buah labu takar 100 mL. Selanjutnya, pada kelima labu takar
tersebut ditambahkan larutan stok standar miconazole masing-
masing 15 mL, 20 mL, 25 mL, 30 mL, dan 35 mL. Lalu encerkan
dengan larutan fase gerak hingga tanda batas.

15020140111
SEDIAAAN OBAT
3. Kelima deret konsentrasi standar tersebut, masing-masing

dilakukan pengukuran dengan kromatografi HPLC.
4. Sampel krim yang diuji mengandung miconazole nitrat 20 mg
dalam 1000 mg krim (2%). Berat krim miconazole adalah 1,0368 g,
berat krim yang digunakan untuk analisis adalah 201,5 mg.
5. Ditimbang 201,5 mg krim dilarutkan dengan 25 mL larutan fase
gerak dalam corong pisah sambil dikocok selama 5 menit.
dikeluarkan/dibuang. Larutan fase gerak dialiri gas nitrogen untuk
menghilangkan sisa heksan, setelah itu dimasukkan ke dalam labu
ukur 100 mL dan diencerkan sampai batas dengan larutan fase
gerak. Saring larutan dan pipet sebanyak 20 mL untuk dilakukan
pengukuran kromatografi HPLC mrnggunakan detector pada UV
pada panjang gelombang 220 nm.
6. Hasil pengukuran HPLC diperoleh data, sebagai berikut :
a. Luas puncak kromatografi sampel miconazole = 119.923.
b. Luas puncak kromatografi pembanding econazole = 124.118.
7. Hitung persentase kadar miconazole dalam krim dan tetapkan
persyaratan sediaan krim miconazole yang tertera dalam

15020140111
SEDIAAAN OBAT
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Pengamatan

Eksternal
A. Tabel
Data obtained from the analysis of paracetamol standard

solutions by HPLC
Consetration of paracetamol Area of chromatographic peak
standard solution (mg/100
mL)
0,5044 17.994
1,009 36.109
1,513 54.121
2,018 71.988
2,522 89.984
Persamaan Linear : y = 35656,585x + 80,803 ; r = 1,000
B. Kurva Baku
Tablet Parasetamol
100,000
y = 35657x + 80.803
80,000 R² = 1
60,000
Area
40,000 Series1
20,000 Linear (Series1)
0
0 1 2 3
Konsentasi
15020140111
SEDIAAAN OBAT

Econazole
1. Tabel
Consetration of Area of Area of Area miconazole
P
miconazole in miconazole econazole Area econazole
e
calibration solution peak peak
r(mg/100 mL)
s 12,09 70.655 123.563 0,5718
a 16,12 96.218 125.376 0,7674
m 20,15 119.793 126.783 0,9449
a 24,18 151.310 127.889 1,183
a 28,21 166.673 125.436 1,329
n
Linear : y = 0,0048x -0,006 ; r = 0,998
2. Kurva Baku

15020140111
SEDIAAAN OBAT
Krim Miconazole
1.6
y = 0.0479x - 0.0058
Area Miconazole/Econazole
1.4
R² = 0.9962
1.2
1
0.8
Series1
0.6
Linear (Series1)
0.4
0.2
0
0 10 20 30
Konsentrasi
4.2 Pembahasan
Analisis kualitatif berupa Identifikasi suatu senyawa adalah suatu
metode yang digunakan untuk mengetahui ada atau tidaknya suatu
senyawa dalam sediaan, penetapan kadar adalah suatu metode yang
digunakan untuk mengetahui banyaknya atau kadar suatu senyawa yang
terdapat dalam suatu sediaan yang kadarnya sesuai dengan yang tertera
dalam literatur, identifikasi dan penetapan kadar suatu senyawa penting
dalam bidang farmasi, karena sediaan yang telah beredar di konsumen,
harus di analisis guna untuk mengetahui apakah sediaan tersebut layak
atau baik untuk digunakan sesuai dengan standarisasi yang ada
Kromatografi adalah suatu metode pemisahan suatu senyawa dari
suatu komponen yang terdapat dalam sampel dengan menggunakan fase
gerak (eluen dan sampel) dan fase diam (silica gel)

15020140111
SEDIAAAN OBAT
(High Performanced Liquid chromatoghraphy) atau KCKT

(Kromatografi Cair Kinerja Tinggi) adalah suatu metode yang digunakan
untuk memisahkan suatu senyawa dari suatu komponen, yang
menggunakan prinsip cair-cair untuk digunakan dalam analisis kualitatif
maupun analisis kuantitatif yang terdiri atas fase gerak (sampel dan
eluen) dan fase diam (silica gel)
metode HPLC) (High Performanced Liquid chromatoghraphy) atau
KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi) metode ini menggunakan prinsip
metode pemisahan suatu senyawa yang terdapat dalam suatu sampel
berdasarkan tingkat kepolarannya, HPLC digunakan khususnya untuk
bahan yang non-volatile (tidak mudah menguap), karena pada alat KCKT
ini digunakan tekanan yang tinggi, dalam HPLC dapat digunakan untuk
analisis kualitatif dan kuantitatif, untuk analisis kualitatif hasilnya dapat
dilihat dari hasil pembacaan berupa kromatogram yang menandakan
waktu retensi suatu senyawa, untuk analisis kuantitatif hasilnya dapat
dilihat dari hasil pembacaan berupa kromatogram yang menunjukkan luas
area
Adapun tujuan dari percobaan ini yaitu menganalisa dan
menentukan kadar suatu sediaan obat tablet parasetamol dengan metode
standar eksternal dan krim Miconazol menggunakan metode standar
internal Econazol.
Dalam percobaan ini sampel yang digunakan adalah tablet
parasetamol dan krim miconazol , dalam hal ini dilakukan analisis
kualitatif dan analisis kuantitatif dengan menggunakan metode HPLC,
untuk analisis kualitatif yaitu untuk mengetahui keberadaan kandungan
kimia yang terdapat dalam sampel dilihat dari hasil pembacaan berupa
kromatogram berdasarkan waktu retensinya, waktu retensi yaitu waktu
yang dibutuhkan sampel dari kolom ke detector, sedangkan analisis

15020140111
SEDIAAAN OBAT
kauntitatif yaitu untuk mengetahui kadar suatu senyawa dalam sampel,

dengan melihat hasil pembacaan berupa kromatogram berdasarkan luas
area yang dibentuk
Untuk percobaan penetapan kadar tablet parasetamol dengan
metode standar eksternal yaitu pertama yang harus dilakukan adalah
Timbang 125 mg parasetamol baku dimasukkan dalam labu takar 250 mL
dan diencerkan dengan larutan asam asetat 0,005 M sampai tanda batas
(larutan stok), Buat seri larutan baku dari larutan stok dengan deret
konsentrasi 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, dan 2,5 mg/100 mL. Dilakukan penetapan
kadar kelima larutan standar diatas dengan HPLC.Ditimbang berat 20
tablet parasetamol yang dianalisis, adalah 12,1891 gram. Serbuk tablet
diambil 150,5 mg dilarutkan dengan asam asetat 0,05 M dalam labu takar
250 mL, lalu disaring. Dipipet 25 mL alikot dan encerkan dengan asam
asetat 0,05 M sampai 100 mL dalam labu takar. Selanjutnya, larutan
diencerkan lebih lanjut dengan mempipet 10 mL ke dalam labu takar 100
mL dengan larutan asam asetat 0,05 M sampai tanda batas. Larutan,
dilakukan penetapan menggunakan kromatografi HPLC pada kondisi
sama pada larutan baku. Adapun hasilnya diperoleh luas puncak
kromatogram = 45.205. Tetapan tablet parasetamol sesuai persyaratan
tablet dalam Farmakope Indonesia.
Untuk percobaan penetapan kadar krim miconazole dengan metode
standar internal econazol yang pertama dilakukan adalah Buat larutan
standar miconazole nitrat dan econazole nitrat (standar internal) dengan
menimbang masing-masing 200,0 mg. Kemudiaan, masing-masing
dilarutkan dengan larutan fase gerak sampai 250 mL dalam labu takar.
Pipet 25 mL larutan econazole stok standar masukkan ke dalam lima
buah labu takar 100 mL. Selanjutnya, pada kelima labu takar tersebut
ditambahkan larutan stok standar miconazole masing-masing 15 mL, 20

15020140111
SEDIAAAN OBAT
mL, 25 mL, 30 mL, dan 35 mL. Lalu encerkan dengan larutan fase
gerak hingga tanda batas. Kelima deret konsentrasi standar tersebut,
masing-masing dilakukan pengukuran dengan kromatografi HPLC.
Sampel krim yang diuji mengandung miconazole nitrat 20 mg dalam 1000
mg krim (2%). Berat krim miconazole adalah 1,0368 g, berat krim yang
digunakan untuk analisis adalah 201,5 mg. Ditimbang 201,5 mg krim
dilarutkan dengan 25 mL larutan fase gerak dalam corong pisah sambil
dikocok selama 5 menit. Ekstraksi dengan 50 mL heksan dari lapisan
heksan dikeluarkan/dibuang. Larutan fase gerak dialiri gas nitrogen untuk
menghilangkan sisa heksan, setelah itu dimasukkan ke dalam labu ukur
100 mL dan diencerkan sampai batas dengan larutan fase gerak. Saring
larutan dan pipet sebanyak 20 mL untuk dilakukan pengukuran
kromatografi HPLC mrnggunakan detector pada UV pada panjang
gelombang 220 nm. Hasil pengukuran HPLC diperoleh data, sebagai
berikut :
c. Luas puncak kromatografi sampel miconazole = 119.923.
d. Luas puncak kromatografi pembanding econazole = 124.118.
Hitung persentase kadar miconazole dalam krim dan tetapkan
persyaratan sediaan krim miconazole yang tertera dalam Farmakope
Indonesia.
Adapun hasil dari perhitungan kadar yang di dapatkan adalah untuk
percobaan penetapan kadar tablet parasetamol dengan metode standar
eksternal kadar yang didapatkan adalah 8,405 %, sedangkan untuk
penetapan kadar miconazol dengan metode standar internal econazol
kadar yang didapatkan adalah 1,95 %.

15020140111
SEDIAAAN OBAT
BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Dari hasil percobaan dapat disimpulkan bahwa hasil % kadar
dari penetapan kadar tablet parasetamol dengan metode standar eksternal
adalah 8,405 % dan hasil % kadar penetapan kadar krim miconazole
dengan metode standar internal econazole adalah 1,95 %.
5.2 Saran
Sebaiknya bahan-bahan di laboratorium lebih di lengkapi, agar semua
praktikum yang ingin di lakukan dapat di kerjakan semuanya. Dan
sebaiknya asisten mendampingi saat praktikum.

15020140111
SEDIAAAN OBAT
DAFTAR PUSTAKA
Andrianingsih, R., 2011, Penggunaan High Performamance Liquid

Chromatography (HPLC) Dalam Proses Analisa Deteksi Ion, Peneliti
Bidang Material Dirgantara, Pusterapan..
Anonim., 2016, Penuntun Praktikum Analisis Instrumen, Universitas Muslim

Indonesia, Makassar.
Clarke. 2005. E.G.C. Prof. Clarke’s Analysis of Drugs and

poisons.Pharmaceutical Press
Ditjen POM, 1979, Farmakope Indonesia Edisi III , Deperteman Kesehatan
RI, Jakarta.
Ditjen POM, 1995, Farmakope Indonesia Edisi IV, Departemen Kesehatan RI,
Jakarta.
Gandjar, I.G., dan Rohman, A. 2012, Kimia Analisis Farmasi, Pustaka

Pelajar, Yogyakarta.
Harvey, R., 2013, Farmakologi Ulasan Bergambar Edisi IV, EGC, Jakarta.
Hartono, Elina,. 2009, Penetapan Kadar Kofein dalam Biji Kopi Secara
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi,Biomedikal. Vol.2 (1)
Lestari, Wahyuni Sri.2014, Validasi Metode Penetapan Kadar Aliskiren dalam

Plasma darah secara In Vitro Menggunakan Kromatografi Cair
Kinerja Tinggi (KCKT), UIN Syarif Hidayatullah, Jakarta.
Naid.T., Syaharuddin.K., Mieke.P., 2011, Penetapan Kadar Parasetamol

Dalam Tablet Kombinasi Parasetamol Dengan Kofein Secara
Spektrofotometri Ultraviolet-Sinar Tampak, Majalah Farmasi dan
Farmakologi, Vol. 15, No. 2, hlm. 77 – 82.
Rachdianti, Henny., Hutagaol, Ricson P., dan Rosdiana, Erna, 2008,

Penentuan Waktu Kelarutan Parasetamol Pada Uji Disolusi, Jurnal
Nusa Kimia, Vol. 8, Bandung.

15020140111
SEDIAAAN OBAT
Clarke. 2005. E.G.C. Prof. Clarke’s Analysis of Drugs and

poisons.Pharmaceutical Press

15020140111
SEDIAAAN OBAT
LAMPIRAN
A. Perhitungan
a. Penetapan Kadar Tablet Parasetamol dengan Metode Standar
Eksternal
150,5 mg 250 mL
25 mL 100 mL (4x)
10 mL 100 mL (10x)
fp = 4 x 10 = 40
𝑦 = 35656,585x + 80,803 ; r = 1,000
𝑦 = 𝑎 + 𝑏𝑥
𝑦−𝑎
𝑥= 𝑏
45.205 − 80,803
𝑥=
35656,585
𝑥 = 1,265mg/L
𝑥. 𝑉
% 𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 = 𝑥𝑓𝑃𝑥 100%
𝐵𝑒𝑟𝑎𝑡𝑆𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
𝑚𝑔
1,265 ( 𝐿 ) 𝑥 0,250 𝐿
% 𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 = 𝑥 40 𝑥 100%
150,5 𝑚𝑔
% 𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 = 8,405%

15020140111
SEDIAAAN OBAT
b. Penetapan Kadar Krim Miconazole dengan Metode Standar

Econazole
200,0 mg 250 mL (800 ppm)
25 mL 100 mL (4x)
fp = 4
𝑦 = 0,048x − 0,006 ; r = 0,998
119.923
𝑦= = 0,966
124.118
𝑦 = 𝑎 + 𝑏𝑥
𝑦−𝑎
𝑥=
𝑏
0,966 + 0,006
𝑥=
0,048
x = 20,25 mg/L
𝑥. 𝑉
% 𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 = 𝑥 𝑓𝑝 𝑥 100%
𝐵𝑒𝑟𝑎𝑡𝑆𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
𝑚𝑔
20,25 ( 𝐿 ) 𝑥 0,250 𝐿
% 𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 = 𝑥 4 𝑥 100%
1036,8 𝑚𝑔
% 𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 = 1,95%

15020140111
SEDIAAAN OBAT
B. Skema Kerja
Eksternal
Timbang 125 mg parasetamol baku dimasukkan dalam labu takar 250
mL
Encerkan dengan larutan asam asetat 0,005 M sampai tanda batas

(larutan stok)
Buat seri larutan baku dari larutan stok dengan deret konsentrasi 0,5,
1,0, 1,5, 2,0, dan 2,5 mg/100 mL
Lakukan penetapan kadar kelima larutan standar diatas dengan HPLC
Timbang berat 20 tablet parasetamol yang dianalisis, adalah 12,1891

gram
Ambil 150,5 mg serbuk tablet
Larutkan dengan asam asetat 0,05 M dalam labu takar 250 mL
Lalu disaring
Pipet 25 mL alikot dan encerkan dengan asam asetat 0,05 M sampai

100 mL dalam labu takar
Encerkan lebih lanjut dengan mempipet 10 mL ke dalam labu takar 100

mL dengan larutan asam asetat 0,05 M

15020140111
SEDIAAAN OBAT
Lakukan penetapan menggunakan kromatografi HPLC

2. Penetapan Kadar Krim Miconazole dengan Metode Standar Internal
Econazole
Timbang miconazole nitrat dan econazole nitrat (standar internal)
masing-masing 200,0 mg
Larutkan masing-masing dengan larutan fase gerak sampai 250 mL

dalam labu takar
Pipet 25 mL larutan econazole stok standar masukkan ke dalam lima

buah labu takar 100 mL
Tambahkan larutan stok standar miconazole masing-masing 15 mL, 20

mL, 25 mL, 30 mL, dan 35 mL
Encerkan dengan larutan fase gerak hingga tanda batas
Lakukan pengukuran dengan kromatografi HPLC
Sampel krim yang diuji mengandung miconazole nitrat 20 mg dalam

1000 mg krim (2%)
Berat krim miconazole adalah 1,0368 g
Timbang 201,5 mg krim

15020140111
SEDIAAAN OBAT
Larutkan dengan 25 mL larutan fase gerak dalam corong pisah sambil

dikocok selama 5 menit

dikeluarkan/dibuang
Larutan fase gerak dialiri gas nitrogen untuk menghilangkan sisa heksan
Masukkan ke dalam labu ukur 100 mL dan diencerkan sampai batas

dengan larutan fase gerak
Disaring larutan
Pipet sebanyak 20 mL untuk dilakukan pengukuran kromatografi HPLC

menggunakan detektor pada UV pada panjang gelombang 220 nm
Hitung persentase kadar miconazole dalam krim

15020140111
SEDIAAAN OBAT
TUGAS RESUME
Pertanyaan kelompok 4
1. Bagaimana pengaruh ukuran partikel terhadap hasil pemisahan
Jawab :
semakin kecil ukuran suatu partikel maka akan mudah terbaca pada
kromatogram, dan semakin besar ukuran partikel maka kemungkinan
akan memekatkan konsentrasi suatu senyawa sehingga peningkatan
analit yang berlebih akan menyebabkan senyawa tersebut tidak
terdeteksi, sehingga kromatogram yang dihasilkan tidak dapat dilihat pick
yang terbentuk karena saling berhimpitan, namun dalam hal ini ukuran
partikel disesuai kan dengan kolom yang memiliki variasi ukuran, jadi jika
parikelnya berukuran kecil maka kolom yang digunakan juga berdiameter
kecil, jika antara partikel dan kolom tidak sesuai ukurannya maka akan
mengganggu proses pemisahan
2. Jelaskan komponen-komponen utama dalam HPLC
(Pertanyaan kelompok 3)
a. Eluent, yang berfungsi sebagai fase gerak yang akam membawa
sampel tersebut masuk ke dalam kolom pemisah.
b. Pompa, yang berfungsi untuk mendorong eluent, dan sampel tersebut
masuk ke dalam kolom.
c. Injector, tempat memasukkan sampel dan kemudian sampel dapat
didistribusikan masuk ke dalam kolom.
d. Kolom pemisah ion, berfungsi untuk memisahkan ion-ion yang ada
dalam sampel, keterpaduan antara kolom dan eluent bias memberikan
hasil/puncak yang maksimal, begitupun sebaliknya, jika tidak ada
“kecocokan” maka tidak akan memunculkan puncak.
e. Detektor, berfungsi membaca ion yang lewat ke dalam detektor.

15020140111
SEDIAAAN OBAT
f. Rekorder data, berfungsi untuk merekam dan mengolah data yang

masuk.
3. Bagaimana hokum vandermaan menghubungkan antara difusi eddy, difusi
longitudinal dan transport massa tak setimbang ?
Pertanyaan Kelompok 1
Jawaban :
• Luas puncak kromatografi pada kurva elusi dipengaruhi oleh tiga
proses perpindahan massa yaitu difusi Eddy, difusi longitudinal dan
transfer massa tidak setimbang. Sedangkan parameter – parameter
yang menentukan berlangsungnya proses – proses tersebut adalah:
laju aliran, ukuran partikel, laju difusi dari ketebalan stasinoner. Van
Deemeter menghubungkan ketiga proses diatas dengan efisiensi
kolom dalam suatu persamaan. Persamaan ini telah teruji dengan
metode kromatografi gas. Menurut Van Deemeter hubungan antara
laju airan (U) dengan tunggi piringan dapat dinyatakan dengan H = A +
𝐵
CxU
𝑈
• A suatu variabel yang berasal dari difusi Eddy, B variabel yang

berhubungan dengan difusi longitudinal, C menyangkut transfer massa
tidak setimbang. Hubungan antara diameter partikel rata-rata dengan
difusi Eddy (A) adalah A = 2λ dR. Dimana λ adalah faktor yang
menjejalan kolom. Sedangkan difusi longitudinal (B) ditimbulkan
sebagai akibat dari kecenderungan molekul untuk berpindah dari
bagian tengah penampang piringan kolom yang konsentrasinya lebih
tinggi kebagian tepi piringan yang konsentrasinya lebih rendah.
Besarnya difusi longitudinal adalah B = 2ψDM, dimana ψ adalah faktor
yang merupakan ukuran rentangan suatu molekul bebas untuk
berdifusi, defangkan DM adalah koefisien difusi zat terlalu didalam fase
bergerak

15020140111
SEDIAAAN OBAT
(Khopar, 1990)

15020140111

HPLC

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

HPLC

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

APLIKASI KROMATOGRAFI HPLC UNTUK PENETAPAN KADAR

1.1 Latar Belakang

ZUMRATUL INAYAH ABDILLAH WADJO S.FARM

hasil berupa kromatogram, alasan mengapa dilakukan penetapan kadar

ZUMRATUL INAYAH ABDILLAH WADJO S.FARM

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Teori Umum

ZUMRATUL INAYAH ABDILLAH WADJO S.FARM

dipengaruhi oleh beberapa parameter diantaranya: Selectivity,

ZUMRATUL INAYAH ABDILLAH WADJO S.FARM

Merupakan parameter yang menghitung efisiensi kromatografi.

ZUMRATUL INAYAH ABDILLAH WADJO S.FARM

komponen-komponen cairan karena perbedaan kekuatan interaksi antara

ZUMRATUL INAYAH ABDILLAH WADJO S.FARM

ZUMRATUL INAYAH ABDILLAH WADJO S.FARM

1. Asam asetat (Ditjen POM, 1979 : 42)

ZUMRATUL INAYAH ABDILLAH WADJO S.FARM

Pemerian : Hablur atau serbuk hablur putih; tidak berwarna;

ZUMRATUL INAYAH ABDILLAH WADJO S.FARM

a. Menggunakan kolom ODS (oktadesisilen,C18) : diameter 4,6 mm

ZUMRATUL INAYAH ABDILLAH WADJO S.FARM

a. Menggunakan kolom ODS : diameter 4,6 mm dan panjang 150

ZUMRATUL INAYAH ABDILLAH WADJO S.FARM

pengukuran kromatografi HPLC mrnggunakan detector pada UV

ZUMRATUL INAYAH ABDILLAH WADJO S.FARM

BAB 3 METODE KERJA

3.1 Alat Praktikum

ZUMRATUL INAYAH ABDILLAH WADJO S.FARM

5. Serbuk tablet diambil 150,5 mg dilarutkan dengan asam asetat

ZUMRATUL INAYAH ABDILLAH WADJO S.FARM

3. Kelima deret konsentrasi standar tersebut, masing-masing

ZUMRATUL INAYAH ABDILLAH WADJO S.FARM

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Pengamatan

Data obtained from the analysis of paracetamol standard

20,000 Linear (Series1)

2. Penetapan Kadar Krim Miconazole dengan Metode Standar

ZUMRATUL INAYAH ABDILLAH WADJO S.FARM

ZUMRATUL INAYAH ABDILLAH WADJO S.FARM

(High Performanced Liquid chromatoghraphy) atau KCKT

ZUMRATUL INAYAH ABDILLAH WADJO S.FARM

kauntitatif yaitu untuk mengetahui kadar suatu senyawa dalam sampel,

ZUMRATUL INAYAH ABDILLAH WADJO S.FARM

ZUMRATUL INAYAH ABDILLAH WADJO S.FARM

BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN

ZUMRATUL INAYAH ABDILLAH WADJO S.FARM

Andrianingsih, R., 2011, Penggunaan High Performamance Liquid

Anonim., 2016, Penuntun Praktikum Analisis Instrumen, Universitas Muslim

Clarke. 2005. E.G.C. Prof. Clarke’s Analysis of Drugs and

Gandjar, I.G., dan Rohman, A. 2012, Kimia Analisis Farmasi, Pustaka

Lestari, Wahyuni Sri.2014, Validasi Metode Penetapan Kadar Aliskiren dalam

Naid.T., Syaharuddin.K., Mieke.P., 2011, Penetapan Kadar Parasetamol

Rachdianti, Henny., Hutagaol, Ricson P., dan Rosdiana, Erna, 2008,

ZUMRATUL INAYAH ABDILLAH WADJO S.FARM

Clarke. 2005. E.G.C. Prof. Clarke’s Analysis of Drugs and

ZUMRATUL INAYAH ABDILLAH WADJO S.FARM

ZUMRATUL INAYAH ABDILLAH WADJO S.FARM

b. Penetapan Kadar Krim Miconazole dengan Metode Standar

ZUMRATUL INAYAH ABDILLAH WADJO S.FARM

Encerkan dengan larutan asam asetat 0,005 M sampai tanda batas

Lakukan penetapan kadar kelima larutan standar diatas dengan HPLC

Timbang berat 20 tablet parasetamol yang dianalisis, adalah 12,1891

Ambil 150,5 mg serbuk tablet