Terdapat beberapa instrumen atau alat yang digunkan untuk untuk menentukan

kadar senyawa aktif suatu obat, salah satunya adalah menggunakan instrumen
kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) atau yang lebih dikenal dengan HPLC (
High Perpormance Liquid Chromatography). Prinsip kerja dari penggunaan HPLC
adalah pemisahan satu atau lebih komponen berdasarkan kepolaran, dimana sampel
atau larutan uji dibawa oleh fase gerak melewati fase diam. Sehingga menyebabkan
larutan uji akan tetrtambat disalah satu fase gerak ataupun fase diamnya dan
kemudian akan terdeteksi oleh detektor, sehingga pada akhirnya dapat diukur kadar
satu atau lebih komponen dari suatu larutan uji.
Berdasarkan pemisahan setiap komponen dalam sampel untuk selanjutnya
diidentifikasi atau secara kualitatif dan dihitung konsentrasi yang terkandung dari
masing-masing komponen tersebut atau secara kuantitatif. Analisis secara kualitatif
bertujuan untuk mengetahui informasi tentang identitas kimia dari analat dalam
suatu sampel. Dan analisis secara kuantitatif bertujuan untuk mengetahui jumlah dan
konsentrasi analat tersebut dalam suatu sampel.
HPLC dapat dignakan untuk senyawa organik yang mudah terurai pada
pemanasan karena HPLC dilakukan pada suhu kamar. Selain senyawa organik
HPLC dapat digunakan untuk menganalisis senyawa anorganik, yang memiliki berat
molekul tinggi dan yang memiliki titik didih yang tinggi.
Paracetamol merupakan serbuk hablur putih, tidak berbau dan memiliki rasa pahit.
Paracetamol larut dalam 70 bagian air, dalam 7 bagian etanol (95%) dan dan dalam 9
bagian propilen glikol, larut dalam larutan alkil hidroksida. ( Depkes RI, 1995)
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan prosedur pemisahan
senyawa campuran berdasarkan perbedaan komponen migrasi, karena adanya perbedaan
koefisien distribusi masing-masing senyawa diantara dua fase yang saling
bersinggungan dan tidak saling campur yaitu merupakan fase gerak dan fase diam.
KCKT merupakan salah satu metode kromatografi cair yang fase geraknya dialirkan
secara cepat dengan bantuan tekanan dan hasilnya dideteksi dengan instrumen. Tuuan
dari KCKT adalah memperoleh hasil pemisahan yang baik dalam waktu relatif singkat.
( Mulja dan suharman, 1995)
 Variabel-variabel yang harus diperhatikan dalam KCKT adalah fase gerak, fase
diam dan detector. Fase gerak pada KCKT sangat berpengaruh terhadap tambatan dan
pemisahan senyawa . fase gerak yang digunakan harus murni untuk mencegah adanya
peak pengganggu yang dapat tumpang tindih dengan peak analit, memiliki titik didih 20
– 50oc diatas temperatur kolom, viskositasnya rendah dan memungkinkan untuk
memperoleh kembali analit dengan mudah, tidak mudah terbakar dan toksisitasnya
rendah, dan memiliki harga yang wajar ( Griter, 1985). Fase diam KCKT yaitu kolom
kromatografi yang merupkan bagian penting karena pemisahan komponen-komponen
sampel terjadi didalam kolom. Kolom pada KCKT dapat ebrupa gelas atau baja tidak
berkarat. Panjang kolom bervariasi antara 15-150cm dengan pengisi kolom biasanya
adalah silika gel, alumunia dan elit ( khopkar, 1990). Detektor yang baik untuk KCKT
yaitu yang memiliki kepekaan tinggi, rentang respon linear lebar, tidak dipengaruhi
perubahan suhu dan aliran, memberikan hasil keterulangan yang baik, dan tidak banyak
derau (Munson, 1984).
Menurut Adnan (1997), komponen utama HPLC yaitu
a. Reservoir pelarut yaitu zat pelarut yang dipakai polaritasnya dapat bervariasi
tergantung dari senyawa yang dianalisis, yang harus diperhatikan yaitu empat
pelarut tersebut harus memungkinkan untuk proses menghilangkan gas atau udara
yang ada dlaam pelarut.
b. Pompa, digunakan untuk mengalirkan pelarut sebagai fase mobile dengan
kecepatan dan tekanan yang tetap
c. Injektor, ketika sampel diinjeksikan kedalam kolom, diharapkan pelarut tidak
mengganggu masuknya keseluruhan sampel kedalam kolom. Injeksi dapat
menggunkan syringe.
d. Kolom kromatografi, kolom yang dipakai memiliki panjang 10-25cm dan diameter
berukuran 5 – 10mmyang diisi dengan fase stasioner berukuran 5-10 mikrometer
dan terbuat dari logam atau stainlesstel.
e. Detektor, digunakan untuk mendeteksi sampel. Detektor dibutuhkan untuk
mempunyai sensitivitas tinggi, linear untuk jangka konsentrasi tertentu dan dapat
mendekati elue tanpa mempengaruhi resolusi kromatografi.
 Pada praktikum kali ini mengenai analisis sirup paracetamol dengan
menggunakan metode KCKT/HPLC. Prinsip dasar HPLC adalah pemisahan
senyawa-senyawa berdasarkan kepolaran, dimana terdapat fase gerak adalah sampel
dan eluen yang bercampur, dan fase diam adalah silika gel yang mengandung
hidrokarbon, sehingga senyawa yang memiliki kepolaran yang lebih tinggi akan
tertahan pada fase diam yang bersifat polar. Metode HPLC dapat digunakan untuk
analisa kuantitatif dan sekaligus kualitatif.
HPLC terdiri dari beberapa komponen utama yang digunakan dalam analisis
sampel. Komponen tersebut yaitu resorvoir pelarut, pompa, kolom, detector, dan
pembuangan. Reservoir pelarut yaitu wadah penyimpanan fase gerak dan biasanya
berbentuk botol kaca dengan adanya selang penghubung. Pompa digunakan untuk
mendorong fase gerak masuk kedalam kolom dengan aliran yang konstan dan
reproducible, pompa yang digunakan harus inert terhadap fase gerak. Kolom,
merupakan jantung pada kromatografi, terdapat fase diam untuk berlangsungnya
proses pemisahan analit. Detektor berfungsi untuk mendeteksi komponen yang
terelusi oleh fase diam sehingga keluar dari kolom dan mengukur jumlah molekul
tersebut hingga dapat dilakukan analisis kuantitatif terhadap sampel yang dianalisis.
Pembuangan atau waste merupakan tempat pembuangan eluen yang sudah melewati
detektor.
Fase gerak biasanya terdiri atas campuran pelarutyang digunakan pada
praktikum yaitu air-metanol dengan perbandingan 3 : 1. Digunakannya air-metanol
karena air-metanol merupakan pelarut universal yang dapat mengelusi senyawa-
senyawa yang bersifat polar. Metanol memenuhi persyaratan sebagai fase gerak
karena tidak terdapatnya kontaminan, tidak bereaksi dengan wadah, dapat
melarutkan sampel, memiliki viskositas rendah, tidak merusak sampel, dan dapat
diperoleh dengan harga murah. Air merupakan pelarut polar, dikombinasikan dengan
metanol diharapkan dapat memperoleh hasil pemisahan efisien. Fase gerak harus
mengalir secara continu dan tidak boleh terdapat gelembung, sehingga perlu
dilakukan flushing dari fase gerak yang digunakan. Flushing mengalirkan fase gerak
langsung ke pembuangan tidak melalui kolom.
 Pada tahap control method merupakan pengaturan sistem yang meliputi module
configuration, yaitu konfigursi tipe dan jenis part yang digunakan untuk pengaturan
run time alat. Pump merupakan pengaturan untuk mengatur apakah sistem isokratik
atau gradient, untuk pengaturan laju alir. Detector merupakan pengaturan panjang
gelombang yang digunakan. Pembuatan operasi pengukuran terdapat dua tipe yaitu
tipe single dan sequence. Pada praktikum digunkan tipe single.
Sebelum dilakukan pengukuran standar dan sampel, dilakukan uji kesesuaian
sistem terlebih dahulu, dengan melakukan injeksi beberapa kali sehingga diperoleh 6
kali ulangan yang memiliki RSD <2%. Uji kesesuaian sistem meliputi beberapa
tahap yaitu pertama persiapan injeksi, syringe yang digunakan adalah syringe 50µl.
Syringe yang akan digunakan harus dibilas terlebih dahulu dengan fase gerak yang
akan digunakan. Tahap kedua yaitu injeksi larutan, tahap ketiga yatu running, pada
tahapan ini sistem kromatografi akan melakukan pemisahan , kemudian analit akan
keluar pada waktu tertentu (time retention) dan terbaca oleh detector. Tahap ke
empat yaitu peak method editor, pengaturan untuk memuncukan nilai-nilai tiap peak.
Tahap kelima yaitu peak id table editor, pengaturan untuk memberi nama masing-
masing peak.
Dasar yang banyak digunakan untuk mengukur kinerja kolom yaitu resolusi dan
efisiensi kolom. Resolusi adalah pemisahan antara dua komponen dalam suatu
campuran, menunjukkan apakah dua komponen terpisah dengan baik. Efisiensi
kolom yaitu dinyatakan dengan jumlah lempeng/plate teoritis (N) dan panjang kolom
yang sesuai dengan jumlah plate teoritis atau HETP (height equivalent to a theoritical
plate). Kolom yang baik memiliki nilai N yang besar dan HETP yang kecil.
Dari hasil analisis, didapatkan kadar paracetamol yaitu 102,9864% hasil yang
didapatkan memenuhi syarat karena masuk kedalam rentang syarat yaitu 90%-110%.
Hasil RSD untuk standar yaitu 0,19976% dan RSD sampel yaitu 0,22236%, hasil yang
didapatkan memenuhi syarat karena <2%. Untuk lempeng teoritis standar didapatkan
5745,553 dan lempeng teoritis sampel 4413,537, hasil yang didapatkan dari N
standar dan N sampel memenuhi syarat yaitu >2500. Untuk hasil HETP standar
didapatkan 0,0261 dan untuk sampel 0,03398. Hasil yang didapatkan untuk HETP
standar dan sampel memenuhi syarat karena masuk kedalam rentang 0,01-1.