BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola

pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang
berada pada larutan.Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati kolom yang merupakan
fase diam.Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom akan cenderung bergerak lebih
lambat dibanding molekul yang berikatan lemah.Dengan ini, berbagai macam tipe molekul dapat
dipisahkan berdasarkan pergerakan pada kolom. Kromatografi digunakan untuk memisahkan
campuran dari substansinya menjadi komponen-komponennya. Seluruh bentuk kromatografi bekerja
berdasarkan prinsip yang sama.Seluruh bentuk kromatografi memiliki fase diam (berupa padatan atau
cairan yang didukung pada padatan) dan fase gerak (cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase
diam dan membawa komponenkomponen dari campuran bersama-sama. Komponen-komponen yang
berbeda akan bergerak pada laju yang berbeda pula.

HPLC didefinisikan sebagai kromatografi cair yang dilakukan dengan memakai fase diam yang
terikat secara kimia pada penyangga halus yang distribusi ukuranya sempit ( kolom ) dan fase gerak
yang dipaksa mengalir dengan laju alir yang terkendali dengan memakai tekanan tinggi sehingga
menghasilkan pemisahan dengan resolusi tinggi dan waktu yang relative singkat. HPLC atau KCKT
merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa
tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang, antara lain : farmasi; lingkungan; bioteknologi;
polimer; dan industri- industri makanan

1.2. Rumusan Masalah

a. Bagaimana prinsip dasar analisis dengan KCKT ?
b. Bagaimana analisis kualitatif dengan KCKT ?

1.3. Tujuan
a. Memahami prinsip dasar analisis dengan KCKT
b. Memahami analisis kualitatif dengan KCKT

BAB II

TINJAUAN PUSATAKA

1.1. Dasar Teori

Parasetamol

Parasetamol (C8H9NO2) atau asetaminofen berupa serbuk hablur, putih, tidak berbau, rasa
sedikit pahit. Mengandung tidak kurang dari 98,0% dan tidak lebih dari 101,0 % C8H9NO2, dihitung
terhadap zat anhidrat. Kelarutannya larut dalam air mendidih dan dalam natrium hidroksida 1 N serta
mudah larut dalam etanol. BM parasetamol adalah 151,16. Parasetamol memiliki khasiat sebagai
analgetikum dan antipiretikum (Depkes RI, 1995).
 Gambar 1. Rumus Struktur Paracetamol (Sumber: Moffat et al., 2005)

Absorbansi parasetamol pada max 245 nm dalam larutan asam adalah sebesar 668a
sedangkan dalam larutan alkali atau basa absorbansinya sebesar 715a pada max 257 nm. Identifikasi:
Sistem HD—k 0.1; sistem HW—k 0.32; sistem HX—RI 264; sistem HY—RI 241; sistem HZ—waktu
retensi 1.9 menit; sistem HAA—waktu retensi 5.6 menit; sistem HAM—waktu retensi 2.0 menit;
sistem HAX—waktu retensi 4.8 menit; sistem HAY—waktu retensi 3.7 menit (Moffat et al., 2005)

High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

High performance liquid chromatography (HPLC) atau yang sering disebut kromatografi cair
kinerja tinggi (KCKT) adalah jenis kromatografi yang penggunaannya paling luas. Pada dasarnya prinsip
kerja HPLC sama dengan kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom, yang membedakan adalah
fasa diam yang digunakan pada HPLC memiliki ukuran yang lebih kecil sehingga luas permukaan besar
sehingga keseimbangan antar fasa menjadi lebih baik dan efisien.

Pada HPLC tekanan yang tinggi menyebabkan fasa gerak dapat bergerak lebih cepat sehingga
difusi menjadi sekecil-kecilnya. Ukuran butir kecil pada fasa diam dan tekanan yang tinggi pada fasa
gerak pada kromatografi kolom cair secara teori akan menghasilkan pemisahan yang sebaik-baiknya

Kegunaan umum HPLC adalah untuk pemisahan dan pemurnian senyawa obat serta untuk
analisis kuantitatif senyawa obat dalam sediaan farmasetika. Disamping itu, HPLC juga digunakan
untuk identifikasi kualitatif senyawa obat berdasarkan pada parameter waktu retensi senyawa obat
standar serta senyawa obat dalam sampel (Gandjar dan Rohman, 2012). Kegunaan HPLC antara lain:

- Untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis

- Analisis ketidakmurnian (impurities)

- Analisis senyawa-senyawa tidak mudah menguap (non volatile)

- Penentuan molekul-molekul netral, ionik, maupun zwitter ion

- Isolasi dan pemurnian senyawa

- Pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir sama

- Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah yang sekelumit (trace element), dalam jumlah
banyak, dan dalam skala proses industri.

(Gandjar dan Rohman, 2007)

Parameter HPLC
 Parameter yang dapat digunakan untuk mengetahui kualitas suatu kromatogram adalah
Resolusi (Rs), Faktor Retensi (k), Faktor selektifitas (α), Efisiensi dan jumlah lempeng teoritis (N).

 Resolusi (Rs)

Hal yang terpenting dari HPLC adalah mengoptimasi resolusi dalam waktu yang minimum. Nilai
resolusi yang melebihi 1,5 diantara dua puncak akan memberikan nilai pemisahan yang baik. Resolusi
dipengaruhi oleh beberapa parameter diantaranya: Selectivity, Effieciency, dan Retention.

 Faktor Retensi (k)

Faktor retensi adalah waktu yang diperlukan untuk membawa keluar suatu komponen dari dalam
kolom kromatografi. Nilai k yang tinggi mengindikasikan sampel memerlukan waktu dalam
berinteraksi dengan fase diam terlebih dahulu hingga keluar dari kolom saat tepat dalam konsentrasi
maksimum.

 Faktor selektifitas (α)

Selektifitas merupakan kemampuan instrumen dalam mengenali senyawa-senyawa dalam

campuran untuk mendapat selektifitas yang maksimum diperlukan interaksi yang sesuai (partisi,
adsorpsi, size exclusion, atau ion exchange). Apabila kedua senyawa memiliki k atau nilai α = 1 kedua
senyawa tidak dapat dipisahkan. akibat waktu retensinya identik. Agar terjadi pemisahan yang baik
maka nilai selektivitas (α) harus lebih besar daripada 1, semakin besar nilai α maka pemisahannya
akan semakin baik. Nilai α dapat diubah-ubah dengan cara, mengubah fasa gerak (misalnya dengan
memperbesar polaritas), mengubah fasa diam, mengubah temperatur karena pada umumnya
kenaikan temperatur akan memperkecil waktu retensi, dan mengubah bentuk komponen

 Efisiensi

Efisiensi kolom merupakan kemampuan kolom mengeluarkan hasil yang diinginkan dengan
memuaskan dan dalam waktu yang singkat. Hasil yang idel kolom yang efisien akan menghasilkan
puncak yang tajam. Efisiensi sangat dipengaruhi oleh kapasitas dari kolom.

 Lempeng teoritis (N)

Merupakan parameter yang menghitung efisiensi kromatografi. Menyatakan jumlah peristiwa

partisi yang dialami oleh analit pada setiap saat yang dibawa oleh fase gerak selama elusi. Dimana
semakin besar harga N akan memberikan puncak yang lebih efisien. (Crawford, 2011)

Instrumen

 Pompa (Pump)
 Fase gerak dalam KCKT adalah suatu cairan yang bergerak melalui kolom. Ada dua tipe pompa
yang digunakan, yaitu kinerja konstan (constant pressure) dan pemindahan konstan (constant
displacement). Pemindahan konstan dapat dibagi menjadi dua, yaitu: pompa reciprocating dan pompa
syringe. Pompa reciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur (pulsating), oleh
karena itu membutuhkan peredam pulsa atau peredam elektronik untuk, menghasilkan garis dasar
(base line) detektor yang stabil, bila detektor sensitif terhadapan aliran. Keuntungan utamanya ialah
ukuran reservoir tidak terbatas. Pompa syringe memberikan aliran yang tidak berdenyut, tetapi
reservoirnya terbatas (Putra, 2004).

 Injektor (Injector)

Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan:

Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran
dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil dan resolusi tidak
dipengaruhi.

Septum: Septum yang digunakan pada KCKT sama dengan yang digunakan pada Kromatografi Gas.
Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60 -70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan
semua pelarut-pelarut kromatografi cair. Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum
injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.

Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari 10 μL
dan dilakukan dengan cara otomatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih
kecil dapat diinjeksikan secara manual). Pada posisi load, sampel diisi kedalam loop pada kinerja
atmosfer, bila valve difungsikan, maka sampel akan masuk ke dalam kolom (Putra, 2004).

 Kolom (Column)

Kolom dapat diklasifikasikan menjadi dua kelompok, yaitu :

Kolom analitik: Diameter dalam 2 - 6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis material pengisi
kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang yang digunakan adalah 50 - 100 cm. Untuk kemasan poros
mikropartikulat, 10 - 30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.

Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan panjang kolom 25 -100 cm
(Putra, 2004).

 Detektor

Detektor dapat dibagi menjadi beberapa macam, yaitu sebagai berikut:

Detektor spektrofotometri UV-Vis

Detektor jenis ini merupakan detektor yang paling banyak digunakan dan sangat berguna untuk
analisis di bidang farmasi karena kebanyakan senyawa obat mempunyai struktur yang dapat
menyerap sinar UV-Vis. Detektor ini didasarkan pada adanya penyerapan radiasi UV dan sinar tampak
pada kisaran panjang gelombang 190-800 nm oleh spesies solut yang mempunyai struktur atau gugus
kromoforik. Sel detektor umumnya berupa tabung dengan diameter 1 mm dan panjang celah optiknya
10 mm, serta diatur sedemikian rupa sehingga mampu menghilangkan pengaruh indeks bias yang
dapat mengubah absorbansi yang terukur.

Detektor Indeks Bias

Detektor indeks bias atau refraktometer diferensial adalah suatu detektor universal yang memberi
tanggap pada setiap zat terlarut, asalkan indeks biasnya jauh berbeda dengan indeks bias fase gerak.
Kelemahan utamanya adalah bahwa indeks bias ini peka terhadap suhu. Karena itu suhu fase gerak,
kolom, dan detektor harus dikendalikan dengan seksama, bila pengukuran yang cermat dilakukan
pada kepekaan tinggi.

Detektor Elektrokimia

Banyak molekul organik, termasuk obat, dapat dioksidasi atau direduksi secara elektrokimia pada
elektrode yang cocok. Arus yang dihasilkan pada proses ini dapat diperkuat untuk menghasilkan
tenaga yang sesuai. Meskipun detektor elektrokimia cukup peka, namun ada pula kelemahannya.
Adanya timbrungan listrik dan goncangan arus juga harus diperhatikan.

Detektor Photodiode-Array (PDA)

Detektor PDA merupakan detektor UV-Vis dengan berbagai keistimewaan. Detektor ini mampu
memberikan kumpulan kromatogram secara simultan pada panjang gelombang yang berbeda dalam
sekali proses (single run). Selama proses berjalan, suatu kromatogram pada panjang gelombang yang
diinginkan (biasanya antara 190-400) dapat ditampilkan. Dengan demikian, PDA memberikan banyak
lebih banyak informasi komposisi sampel disbanding dengan detector UV-Vis. Dengan detektor ini,
juga diperoleh spectrum UV tiap puncak yang terpisah sehingga dapat dijadikan sebagai alat yang
penting untuk memilih panjang gelombang maksimal untuk sistem KCKT yang digunakan. Dan akhirnya
dengan detektor ini pula, dapat dilakukan uji kemurnian puncak dengan membandingkan antara
spectra analit dengan spectra senyawa yang sudah diketahui.

Spektrum dan kromatogram yang dihasilkan pada detektor PDA ini dapat ditampilkan sebagai plot 3
dimensi absorbansi, panjang gelombang, dan waktu sehingga data ini dapat dimanipulasi dan
diplotkan kembali pada layar (monitor) lalu dibandingkan dengan data 3 dimensi senyawa lain dari
perpustakaan data yang ada di sistem komputernya sehingga bisa digunakan untuk tujuan identifikasi
(Gandjar dan Rohman, 2007).

Keuntungan HPLC

 Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari1 jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikan
sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit (uncomplicated), waktu analisis kurang
dari 5 menit bisa dicapai
 Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana interaksi
selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat;
pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa diam. Kemampuan zat padat berinteraksi
secara selektif dengan fasa diam dan fasa gerak pada KCKT memberikan parameter tambahan
untuk mencapai pemisahan yang diinginkan.
 Sensitivitas detektor: Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat
mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam- macam zat. Detektor-
detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram(10-12
 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll
dapat juga digunakan dalam KCKT
 Kolom yang dapat digunakan kembali: Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom
KCKT dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom
yang sma sebelum darijenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven
yang digunakan Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik :zat – zat yang tidak bisa
dianalisis dengan KG karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk menganalisi
spsesies ionik. KCKT dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis zat –
zat tersebut.
 Mudah rekoveri sampel: Umumnya setektor yang digunakan dalam KCKT tidak menyebabkan
destruktif(kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh karena itu komponen
sampel tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah melewati detector.Solvennya
dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukarion memerlukan
prosedur khusus.

(Effendy De Lux Putra, 2004: 8)

Kekurangan HPLC

 Harga sebuah alat HPLC cukup mahal.

 Sering ada larutan standar yang tertinggal diinjektor.
 Pada kolom dengan diameter rata-rata partikel fase diam dengan ukuran 5 dan 3
mikrometer sela-sela partikel lebih mudah tertutup oleh kotoran, jadi harus seringkali dicuci
dan kemurnian larutan harus dijaga.

DAFTAR PUSTAKA

Gandjar, G.H., dan Rohman, A., (2007). Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar: Yogyakarta: hal.120,
164, 166.

Putra, Effendy De Lux. (2004). Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang Farmasi, 8

Moffat, A.C., et al. 2005. Clarke’s Analysis of Drugs and Poisons Pharmaceutical Press

Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1995, Farmakope Indonesia, Edisi IV, 606, Departemen
Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta