I.

II.

Judul Percobaan

Tanggal Percobaan : Kamis, 18 Desember 2014

III.

Selesai Percobaan

: Kamis, 18 Desember 2014

IV.

Tujuan

Dasar Teori

V.

High Performance Liquid Chromatography HPLC

High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau yang sering disebut
kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) adalah jenis kromatografi yang
penggunaannya paling luas. Kegunaan umum HPLC adalah untuk pemisahan dan
pemurnian senyawa obat serta untuk analisis kuantitatif senyawa obat dalam sediaan
farmasetika. Disamping itu, HPLC juga digunakan untuk identifikasi kualitatif
senyawa obat berdasarkan pada parameter waktu retensi senyawa obat standar serta
senyawa obat dalam sampel (Gandjar dan Rohman, 2012). Kegunaan HPLC antara
lain:

Untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa

biologis

Analisis ketidakmurnian (impurities)

Analisis senyawa-senyawa tidak mudah menguap (non volatile)

Penentuan molekul-molekul netral, ionik, maupun zwitter ion

Isolasi dan pemurnian senyawa

Pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir sama

Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah yang sekelumit (trace element),

dalam jumlah banyak, dan dalam skala proses industri.
(Gandjar dan Rohman, 2007)

Parameter HPLC
Parameter

yang

dapat

digunakan

untuk

mengetahui

kualitas

suatu

kromatogram adalah Resolusi (Rs), Faktor Retensi (k), Faktor selektifitas (),
Efisiensi dan jumlah lempeng teoritis (N).
- Resolusi (Rs)
Hal yang terpenting dari HPLC adalah mengoptimasi resolusi dalam waktu
yang minimum. Nilai resolusi yang melebihi 1,5 diantara dua puncak akan
memberikan nilai pemisahan yang baik. Resolusi dipengaruhi oleh beberapa
parameter diantaranya: Selectivity, Effieciency, dan Retention.

- Faktor Retensi (k)

Faktor retensi adalah waktu yang diperlukan untuk membawa keluar suatu
komponen dari dalam kolom kromatografi. Nilai k yang tinggi mengindikasikan
sampel memerlukan waktu dalam berinteraksi dengan fase diam terlebih dahulu
hingga keluar dari kolom saat tepat dalam konsentrasi maksimum.
- Faktor selektifitas ()
Selektifitas merupakan kemampuan instrumen dalam mengenali senyawasenyawa dalam campuran untuk mendapat selektifitas yang maksimum diperlukan
interaksi yang sesuai (partisi, adsorpsi, size exclusion, atau ion exchange). Apabila
kedua senyawa memiliki k atau nilai = 1 kedua senyawa tidak dapat dipisahkan.
akibat waktu retensinya identik. Agar terjadi pemisahan yang baik maka nilai
selektivitas () harus lebih besar daripada 1, semakin besar nilai maka
pemisahannya akan semakin baik. Nilai dapat diubah-ubah dengan cara, mengubah
fasa gerak (misalnya dengan memperbesar polaritas), mengubah fasa diam, mengubah
temperatur karena pada umumnya kenaikan temperatur akan memperkecil waktu
retensi, dan mengubah bentuk komponen
- Efisiensi
Efisiensi kolom merupakan kemampuan kolom mengeluarkan hasil yang
diinginkan dengan memuaskan dan dalam waktu yang singkat. Hasil yang idel kolom
yang efisien akan menghasilkan puncak yang tajam. Efisiensi sangat dipengaruhi oleh
kapasitas dari kolom.
- Lempeng teoritis (N)
Merupakan parameter yang menghitung efisiensi kromatografi. Menyatakan
jumlah peristiwa partisi yang dialami oleh analit pada setiap saat yang dibawa oleh
fase gerak selama elusi. Dimana semakin besar harga N akan memberikan puncak
yang lebih efisien.
(Crawford, 2011)

Instrumen

Gambar 1. Skema Alat HPLC

a.

Pompa (Pump)
Fase gerak dalam KCKT adalah suatu cairan yang bergerak melalui
kolom. Ada dua tipe pompa yang digunakan, yaitu kinerja konstan (constant
pressure) dan pemindahan konstan (constant displacement). Pemindahan
konstan dapat dibagi menjadi dua, yaitu: pompa reciprocating dan pompa
syringe. Pompa reciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur
(pulsating), oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau peredam
elektronik untuk, menghasilkan garis dasar (base line) detektor yang stabil, bila
detektor sensitif terhadapan aliran. Keuntungan utamanya ialah ukuran reservoir
tidak terbatas. Pompa syringe memberikan aliran yang tidak berdenyut, tetapi
reservoirnya terbatas (Putra, 2004).

b.

Injektor (Injector)
Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan:
1) Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir,

sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan
karena difusi di dalam cairan kecil dan resolusi tidak dipengaruhi.
2) Septum: Septum yang digunakan pada KCKT sama dengan yang digunakan

pada Kromatografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai
60 -70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut
kromatografi cair. Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum
injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.
3) Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi

volume lebih besar dari 10 L dan dilakukan dengan cara otomatis (dengan

menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat

diinjeksikan secara manual). Pada posisi load, sampel diisi kedalam loop
pada kinerja atmosfer, bila valve difungsikan, maka sampel akan masuk ke
dalam kolom (Putra, 2004).

c.

Kolom (Column)
Kolom dapat diklasifikasikan menjadi dua kelompok, yaitu :
1) Kolom analitik: Diameter dalam 2 - 6 mm. Panjang kolom tergantung pada
jenis material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang yang
digunakan adalah 50 - 100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat, 10 30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.
2) Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan
panjang kolom 25 -100 cm (Putra, 2004).

d.

Detektor
Detektor dapat dibagi menjadi beberapa macam, yaitu sebagai berikut:
1) Detektor spektrofotometri UV-Vis
Detektor jenis ini merupakan detektor yang paling banyak digunakan dan
sangat berguna untuk analisis di bidang farmasi karena kebanyakan
senyawa obat mempunyai struktur yang dapat menyerap sinar UV-Vis.
Detektor ini didasarkan pada adanya penyerapan radiasi UV dan sinar
tampak pada kisaran panjang gelombang 190-800 nm oleh spesies solut
yang mempunyai struktur atau gugus kromoforik. Sel detektor umumnya
berupa tabung dengan diameter 1 mm dan panjang celah optiknya 10 mm,
serta diatur sedemikian rupa sehingga mampu menghilangkan pengaruh
indeks bias yang dapat mengubah absorbansi yang terukur.
2) Detektor Indeks Bias
Detektor indeks bias atau refraktometer diferensial adalah suatu detektor
universal yang memberi tanggap pada setiap zat terlarut, asalkan indeks
biasnya jauh berbeda dengan indeks bias fase gerak. Kelemahan utamanya
adalah bahwa indeks bias ini peka terhadap suhu. Karena itu suhu fase
gerak, kolom, dan detektor harus dikendalikan dengan seksama, bila
pengukuran yang cermat dilakukan pada kepekaan tinggi.
3) Detektor Elektrokimia

Banyak molekul organik, termasuk obat, dapat dioksidasi atau direduksi

secara elektrokimia pada elektrode yang cocok. Arus yang dihasilkan pada
proses ini dapat diperkuat untuk menghasilkan tenaga yang sesuai.
Meskipun

detektor

elektrokimia

cukup

peka,

namun

ada

pula

kelemahannya. Adanya timbrungan listrik dan goncangan arus juga harus

diperhatikan.
4) Detektor Photodiode-Array (PDA)
Detektor PDA merupakan detektor UV-Vis dengan berbagai keistimewaan.
Detektor ini mampu memberikan kumpulan kromatogram secara simultan
pada panjang gelombang yang berbeda dalam sekali proses (single run).
Selama proses berjalan, suatu kromatogram pada panjang gelombang yang
diinginkan (biasanya antara 190-400) dapat ditampilkan. Dengan demikian,
PDA memberikan banyak lebih banyak informasi komposisi sampel
disbanding dengan detector UV-Vis. Dengan detektor ini, juga diperoleh
spectrum UV tiap puncak yang terpisah sehingga dapat dijadikan sebagai
alat yang penting untuk memilih panjang gelombang maksimal untuk
sistem KCKT yang digunakan. Dan akhirnya dengan detektor ini pula,
dapat dilakukan uji kemurnian puncak dengan membandingkan antara
spectra analit dengan spectra senyawa yang sudah diketahui.
Spektrum dan kromatogram yang dihasilkan pada detektor PDA ini dapat
ditampilkan sebagai plot 3 dimensi absorbansi, panjang gelombang, dan waktu
sehingga data ini dapat dimanipulasi dan diplotkan kembali pada layar (monitor)
lalu dibandingkan dengan data 3 dimensi senyawa lain dari perpustakaan data
yang ada di sistem komputernya sehingga bisa digunakan untuk tujuan
identifikasi (Gandjar dan Rohman, 2007).

Metode Validasi
Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter
tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter
tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita, 2004). Validasi
metode menurut United States Pharmacopeia (USP) dilakukan untuk menjamin
bahwa metode analisis akurat, spesifik, reprodusibel, dan tahan pada kisaran analit
yang akan dianalisis (Gandjar dan Rohman,2007).

Suatu metode analisis harus divalidasi untuk melakukan verifikasi bahwa

parameter-parameter kinerjanya cukup mampu untuk mengatasi problem analisis,
karenanya suatu metode harus divalidasi ketika:
a. Metode baru dikembangkan untuk mengatasi problem analisis tertentu.
b. Metode yang sudah baku direvisi untuk menyesuaikan atau karena munculnya
suatu problem yang mengarahkan bahwa metode baku tersebut harus direvisi.
c. Penjaminan mutu yang mengindikasikan bahwa metode baku telah berubah seiring
dengan berjalannya waktu.
d. Metode baku digunakan di laboratorium yang berbeda, atau dikerjakan dengan alat
yang berbeda.
e. Untuk mendemonstrasikan kesetaraan antar dua metode, seperti antara metode baru
dan metode baku.
(Gandjar dan Rohman, 2007)

Kelebihan dan Kekurangan Metode Analisis dengan HPLC

1. Kelebihan

Kerja lebih mudah dengan automatisasi dalam prosedur analisis dan

pengolahan data.

Volume sampel kecil.

Daya pisah tinggi.

Merupakan metode analitis cepat, peka, akurat, tepat, reproducible, dan

preparatif.

Dapat digunakan untuk analisis sampel organic dan anorganik, bersifat volatile
dan non-volatil, stabil dan tidak stabil secara thermal.

Pilihan fasa diam dan fasa geraknya luas

2. Kekurangan

Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu.

Hanya bisa digunakan untuk asam organik.

Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan

gradient elusi.

Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang

terbatas

Asam Asetat
Asam asetat atau acetic acid atau ethanoic acid adalah senyawa organik yang
termasuk dalam golongan carboxylic acid dengan gugus fungsinya adalah:

Sedangkan rumus kimia dari asam asetat sendiri adalah:

Acetic acid adalah monoprotic acid yang lemah, sehingga hanya hanya
sebagian kecil ion saja yang dapat terdisosiasi dalam air dan reaksi ini ada
kesetimbangannya dapat bergeser ke kiri atau ke kanan tergantung pada kondisi dari
reaksi. Proses terdisosiasinya asam asetat dalam air dapat digambarkan seperti
berikut:

Gambar 1. Reaksi disosiasi asam asetat dalam air

Karakteristik dari carboxylic acid dapat dilihat pada tabel 1 di bawah. Bau
dari carboxylic acid sangat tidak enak dan gugus OH- pada carboxylic acid tidak
berperilaku seperti basa ion hidroksida OH-. Hal ini terjadi karena Oksigen memiliki
sifat keelektronegatifan yang tinggi sehingga dengan adanya dua atom

Tabel 1. Karakteristik Carboxylic acid

Daftar Pustaka
Anonim. 2001. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. http://upi.edu/direktori/fpmipa/jur_
pend._kimia.Hokcu_suhanda/kuliah_kimia_instrumen/kckt.pdf. (Diakses pada
tanggal 21 Desember 2014).
Anonim. Skripsi. (online) http://lontar.ui.ac.id/file?file=digital/131646-T%2027510Studi%20ketahanan-Tinjauan%20literatur.pdf. (Diakses pada tanggal 20
Desember 2014).
Efendy D.L.P. 2004. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang Farmasi.
http://epository.usu.ac.id/bitstream/123456789/3616/1/farmasi-effendy2.pdf.
(Diakses pada tanggal 21 Desember 2014).
Surya, Kharismala, et al. 2011. Metode Pemisahan Kimia HPLC. http://webcache.
googleusercontent.com/pdf. (Diakses pada tanggal 21 Desember 2014).