KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

I.

TUJUAN
Menjelaskan teori kromatografi cair kinerja tinggi
Mengoperasikan alat kromatografi cair dengan baik dan benar
Menganalisa suatu senyawa kimia baik secara kuantitatif maupun

kualitatif dengan menggunakam alat kromatografi cair tekanan tinggi

Dapat melakukan preparasi dengan tepat dan akurat, serta dapat

mengikuti manual pengoperasian HPLC.

Dapat menentukan/menghitung kadar zat aditif dalam sampel minuman.

II.

ALAT DAN BAHAN YANG DIGUNAKAN

Seperangkat alat HPLC atau KCKT
Kolom c-18
Syringe
Penyaring milipole
Neraca analitik
Labu tukar
Pipet volum
Corong gelas
Gelas kimia
Gelas pipa

III.

DASAR TEORI

3.1 Pengertian HPLC

Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan High
Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode yang tidak destruktif
dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. HPLC secara
mendasar merupakan sebuah perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom.
Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom di bawah pengaruh gravitasi, HPLC
didukung oleh pompa yang dapat memberikan tekanan tinggi sampai dengan 400 atm.
3.2 Jenis- Jenis HPLC
1. Kromatografi Adsorbsi

Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi

kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya
menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina,
meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya.
Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut.
Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat
terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.
2. Kromatografi fase terikat (Kromatografi Partisi)
Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara
kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah
hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau
dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau
C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau
dengan larutan bufer.
3. Kromatografi penukar ion
HPLC penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau
anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran,
meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin.
Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air
karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya airalkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air,
retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH
fase gerak.
4. Kromatografi Pasangan ion
Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampelsampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion.
Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.
5. Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat
digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000
dalton. Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus

sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase
diam.
6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang
sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat
menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik
tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan
antibodi). Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim)
dari campuran yang sangat kompleks.
3.3 Kelebihan dan Kekurangan KCKT
KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan kromatografi cair
klasik, antara lain:
Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat
diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit (uncomplicated),
waktu analisis kurang dari 5 menit bisa dicapai
Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana
interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan
zat padat; pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa diam. Kemampuan zat padat
berinteraksi secara selektif dengan rasa diam dan rasa gerak pada KCKT memberikan
parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang diinginkan.
Sensitivitas detektor : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat
mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam- macam zat.
Detektor-detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai
picogram (10-12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks
Refraksi, Radiometri, dll dapat juga digunakan dalam KCKT.
Kolom yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom kromatografi klasik,
kolom KCKT dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang bisa dilakukan
dengan kolom yang sma sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari
solven dan jenis solven yang digunakan.
Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik : zat zat yang tidak bisa dianalisis
dengan KG karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk menganalisis

psesies ionik. KCKT dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk
mengalissis zat zat tersebut.
Mudah rekoveri sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam KCKT tidak
menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh
karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah sikumpulkan setelah
melewati detector. Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk
kromatografi penukar ion memerlukan prosedur khusus.
Dismping kelebihan diatas, KCKT juga memiliki kekurangan, yaitu :
Mahal
Sampel yang digunakan jumlahnya sedikit
Perlu tenaga ahli untuk mengoperasikan
3.4 Instrumentasi HPLC
Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat untuk
memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase
gerak,

dan

suatu

komputer

atau

integrator

atau

perekam.

Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :

1. Pompa (Pump)
Fase gerak dalam KCKT adalah suatu cairan yang bergerak melalui kolom. Ada
dua tipe pompa yang digunakan, yaitu kinerja konstan (constant pressure) dan
pemindahan konstan (constant displacement). Pemindahan konstan dapat dibagi
menjadi dua, yaitu: pompa reciprocating dan pompa syringe. Pompa reciprocating
menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur (pulsating),oleh karena itu
membutuhkan peredam pulsa atau peredam elektronik untuk, menghasilkan garis dasar
(base line) detektor yang stabil, bila detektor sensitif terhadapan aliran. Keuntungan

utamanya ialah ukuran reservoir tidak terbatas. Pompa syringe memberikan aliran yang
tidak berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas.
2. Injektor (injector)
Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan disturbansi
yang minimum dari material kolom. Ada dua model umum :
a. Stopped Flow
b. Solvent Flowing
Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :
a. Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem
tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di
dalam cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi
b.

Septum: Septum yang digunakan pada KCKT sama dengan yang digunakan
pada Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60 -70
atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut
Kromatografi Cair.Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum
injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.

b. Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume
lebih besar dari 10 dan dilakukan dengan cara automatis (dengan
menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksifan
secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi kedalam loop pada kinerja
atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka sampel akan masuK ke dalam kolom.
3. Kolom
Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung
pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom dapat dibagi menjadi
dua kelompok :
a. Kolom analitik : Diameter dalam 2 -6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis
material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang yang digunakan
adalah 50 -100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat, 10 -30 cm. Dewasa
ini ada yang 5 cm.

b. Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan

panjang kolom 25 -100 cm.
Kolom umumnya dibuat dari stainlesteel dan biasanya dioperasikan pada
temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama untuk
kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Pengepakan kolom tergantung
pada model KCKT yang digunakan (Liquid Solid Chromatography, LSC; Liquid Liquid
Chromatography,

LLC;

Ion

Exchange

Chromatography,

IEC,

Exclution

Chromatography, EC)
4. Detektor
Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di dalam
kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadamya (analisis kuantitatif).Detektor yang
baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar respons
linier yang luas, dan memberi respons untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang
rendah terhadap aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu
dapat diperoleh.
Detektor KCKT yang umum digunakan adalah detektor UV 254 nm. Variabel
panjang gelombang dapat digunakan untuk mendeteksi banyak senyawa dengan range
yang lebih luas. Detektor indeks refraksi juga digunakan secara luas, terutama pada
kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif jika dibandingkan dengan
detektor UV. Detektor-detektor lainnya antara lain:
-

Detektor Fluorometer
Detektor lonisasi nyala

Detektor Spektrofotometer Massa

Detektor Refraksi lndeks

Detektor Elektrokimia

Detektor Reaksi Kimia

5.

Sistem penyuntik
Teknik penyuntikan harus dilakukan dengan cepat untuk mencapai ketelitian

maksimum analisis kuantitatif. Yang terpenting sistem harus dapat mengatasi tekanan
balik yang tinggi tanpa kehilangan terokan. Pada saat pengisian terokan, terokan
dialirkan melewati lekuk dan kelebihanya dikeluarkan ke pembuang. Pada saat
penyuntikan, katup diputar sehingga fase gerak mengalir melewati lekuk ke kolom.

6. Tendon pelarut
Tendon pelarut atau fase gerak mempunyai ciri yaitu bahan tendon harus
lembam terhadap berbagai fase gerak berair dan tak berair. Sehingga baja anti karat
jangan dipakai pada pelarut yang mengandung ion halida dan jika harus bertekanan,
hindari menggunakan gelas. Daya tampung tendon harus lebih besar dari 500 ml yang
dapat digunakan selama 4 jam untuk kecepatan alir yang umumnya 1 2 ml/menit.
7.

Elusi Gradien
Elusi Gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fasa gerak selama

analisis kromatografi berlangsung. Efek dari Elusi Gradien adalah mempersingkat

waktu retensi dari senyawa-senyawa yang tertahan kuat pada kolom. Dasar-dasar elusi
gradien dijelaskan oleh Snyder.
Elusi Gradien menawarkan beberapa keuntungan :
a. Total waktu analisis dapat direduksi
b. Resolusi persatuan waktu setiap senyawa dalam campuran bertambah
c. Ketajaman Peak bertambah (menghilangkan tailing)
d. Efek sensitivitas bertambah karena sedikit variasi pada peak
8. Pengolahan Data (Data Handling)
Hasil dari pemisahan kromatografi biasanya ditampilkan dalam bentuk
kromatogram pada rekorder. Suatu tipe Kromatogram dapat dilihat pada Gambar 3. 2
berikut ini

Gambar 3.2 : kromatogram dari senyawa 5 Nukleotida

Dari Gambar 3.2. waktu retensi dan volume retensi dapat diketahui /dihitung.
Lni bisa digunakan untuk mengidentifikasi secara kualitatif suatu komponen, bila
kondisi kerja dapat dikontrol. Lebar puncak dan tinggi puncak sebanding atau
proporsional dengan konsentrasi dan dapat digunakan untuk memperoleh hasil secara
kuantitatif.
9.

Fasa gerak
Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau rasa gerak adalah salah

satu dari variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi yang sangat luas
pada solven yang digunakan untuk KCKT, tetapi ada beberapa sifat umum yang sangat
disukai, yaitu rasa gerak harus :
1. Murni, tidak terdapat kontaminan
2. Tdak bereaksi dengan wadah (packing)
3. Sesuai dengan defektor
4. Melarutkan sampel
5. Memiliki visikositas rendah
6. Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery"
7. Diperdagangan dapat diperoleh dengan harga murah
3.5 Aplikasi HPLC
HPLC juga cocok digunakan untuk memisahkan minyak atsiri. Minyak atsiri
terdiri atas campuran yang sangat rumit dan oleh karena itu HPLC berguna untuk
memisahkan

campuran

memisahkan

golongan

rumit

menjadi

senyawa

golongan-golongan

menjadi

senyawa

atau

komponen-komponennya.

HPLC digunakan untuk memisahkan golongan minyak, misalnya terpenoid tinggi,

segala senyawa jenis fenol, alkaloid, lipid dan gula. HPLC baik digunakan untuk
senyawa yang dapat dideteksi di daerah spekrum UV atau spectrum sinar tampak.
Kolom yang tersedia mempunyai banyak sekali pelat teori (lebih dari 100.000 untuk
kolom 100 cm), dan kromatografi dilakukan dalam kondisi mendekati kondisi ideal
demikian rupa sehingga dapat diperoleh dalam beberapa menit dan ditafsirkan
secara kuantitatif dengan ketepatan yang lumayan. Cuplikan dapat dipisahkan secara
preparative.

Penentuan Kafein :
Kafein adalah suatu senyawa organik yang mempunyai nama lain yaitu
kafein, tein, atau 1,3,7-trimetilxantin. Kristal kafein dalam air berupa jarum-jarum
bercahaya.Bila tidak mengandung air, kafein meleleh pada suhu 234oC 239oC
dan menyublim pada suhu yang lebih rendah. Kafein mudah larut dalam air panas
dan kloroform, tetapi sedikit larut dalam air dingin dan alkohol (Abraham, 2010)
Kafeina[3][4], atau lebih populernya kafein, ialah senyawa alkaloid xantina
berbentuk kristal dan berasa pahit yang bekerja sebagai obat perangsang psikoaktif
dan diuretik ringan[5]. Kafeina ditemukan oleh seorang kimiawan Jerman,
Friedrich Ferdinand Runge, pada tahun 1819. Ia menciptakan istilah "kaffein" untuk
merujuk pada senyawa kimia pada kopi.[6]
Kafeina juga disebut guaranina ketika ditemukan pada guarana, mateina ketika
ditemukan pada mate, dan teina ketika ditemukan pada teh. Semua istilah tersebut
sama-sama merujuk
pada senyawa kimia yang sama. Kafeina dijumpai secara alami pada bahan pangan
seperti biji kopi, daun teh, buah kola, guarana, dan mat. Pada tumbuhan, ia
berperan sebagai pestisida alami yang melumpuhkan dan mematikan seranggaserangga tertentu yang memakan tanaman tersebut. Ia umumnya dikonsumsi oleh
manusia dengan mengekstraksinya dari biji kopi dan daun teh. Kafeina merupakan
obat perangsang sistem pusat saraf pada manusia dan dapat mengusir rasa kantuk
secara sementara.Minuman yang mengandung kafeina, seperti kopi, teh, dan
minuman ringan, sangat digemari.Kafeina merupakan zat psikoaktif yang paling
banyak dikonsumsi di dunia.Tidak seperti zat psikoaktif lainnya, kafeina legal dan
tidak diatur oleh hukum di hampir seluruh yuridiksi dunia. Di Amerika Utara, 90%
orang dewasa mengkonsumsi kafeina setiap hari (Anonim, 2010)
Kopi adalah sejenis minuman yang berasal dari proses pengolahan dan ekstraksi biji
tanaman kopi.[2] Kata kopi sendiri berasal dari bahasa Arab qahwah yang berarti
kekuatan, karena pada awalnya kopi digunakan sebagai makanan berenergi tinggi.

[3] Kata qahwah kembali mengalami perubahan menjadi kahveh yang berasal dari
bahasa Turki dan kemudian berubah lagi menjadi koffie dalam bahasa Belanda.
[rujukan?] Penggunaan kata koffie segera diserap ke dalam bahasa Indonesia
menjadi kata kopi yang dikenal saat ini.[3] Secara umum, terdapat dua jenis biji
kopi, yaitu arabika (kualitas terbaik) dan robusta.[4] Sejarah mencatat bahwa
penemuan kopi sebagai minuman berkhasiat dan berenergi pertama kali ditemukan
oleh Bangsa Etiopia di benua Afrika sekitar 3000 tahun (1000 SM) yang lalu.[5]
Kopi kemudian terus berkembang hingga saat ini menjadi salah satu minuman
paling populer di dunia yang dikonsumsi oleh berbagai kalangan masyarakat.
[rujukan?] Indonesia sendiri telah mampu memproduksi lebih dari 400 ribu ton kopi
per tahunnya.[6] Di samping rasa dan aromanya yang menarik, kopi juga dapat
menurunkan risiko terkena penyakit kanker, diabetes, batu empedu, dan berbagai
penyakit jantung (kardiovaskuler) (Anonim, 2010)
Kafein merupakan jenis alkaloid yang secara alamiah terdapat dalam biji kopi, daun
teh, daun mete, biji kola, biji coklat, dan beberapa minuman penyegar.Kafein
memiliki berat molekul 194.19 dengan rumus kimia C8H10N8O2 dan pH 6.9
(larutan kafein 1% dalam air). Secara ilmiah, efek langsung dari kafein terhadap
kesehatan sebetulnya tidak ada, tetapi yang ada adalah efek tak langsungnya seperti
menstimulasi pernafasan dan jantung, serta memberikan
efek samping berupa rasa gelisah (neuroses), tidak dapat tidur (insomnia), dan
denyut jantung tak berarturan (tachycardia). Dari beberapa literatur, diketahui
bahwa kopi dan teh banyak mengandung kafein dibandingkan jenis tanaman lain,
karena tanaman kopi dan teh menghasilkan biji kopi dan daun teh dengan sangat
cepat, sementara penghancurannya sangat lambat (Hermanto, 2007)
Tapi, di balik kandungan kafein yang lumayan besar itu, kopi sebetulnya memiliki
segudang manfaat bagi manusia.Khasiat kopi yang sudah umum dikenal orang
sejak dulu adalah mengurangi rasa kantuk dan lelah.Kafein yang terkandung
dalam kopi mampu merangsang sistem saraf pusat, sehingga kita bisa berpikir

cemerlang, tidak mengantuk, dan konsentrasi kita terjaga.Ini karena saraf kita
terstimulasi,

terang

Saptawati

Bardosono,

pakar

gizi

dari

Universitas

Indonesia.Selain itu, senyawa kafein yang tergolong alkaloid itu sebetulnya juga
mampu meningkatkan kewaspadaan saraf motorik.Kafein pun menimbulkan
perangsangan pada sistem pernafasan dan sistem pembuluh darah dan jantung.
Hasilnya, orang yang meminum kopi akan mampu lebih berkonsentrasi dalam
melakukan pekerjaannya. Selain itu, orang akan merasa lebih segar setelah
meminum kopi. Hal inilah yang membuat banyak
orang mengkonsumsi kopi di pagi hari. Namun, teori itu ditentang oleh Profesor
Peter Rogers dari Universitas Bristol, Inggris. Menurut penelitian yang
dilakukannya, kafein yang terkandung dalam kopi tersebut tidak akan akan
memunculkan khasiat-khasiat itu bila orang yang meminumnya sudah terbiasa
dengan pengaruh kafein (Anonim, 2008).

IV.

PROSEDUR PERCOBAAN

A. Operasional Kromatografi Cair

Catatan : Jangan pernah membiarkan pompa beroperasi tanpa filter pelarut terendam
dalam pelarut. Pilih panjang gelombang UV-sinar tampak dan nyalakan detektor untuk
standby.Setelah 1 menit nyalakan detektor ke posisi ON. Pengaturan 0,04AUFS akan
cukup.
Jika pompa belum dinyalakan, pertama pilih solvent line yang diperlukan
(solvent select dial) dan keluarkan solvent line dengan gambar sekitar 20 mL pelarut

keluar melalui flush outlet (berada dibawah solvent select dial).Lakukan ini dengan
menggunakan syringe, masukkan dalam outlet, buka katup dan keluarkan solvent.Tutup
katup kembali.
Pada saat pelarut telah terpilih dengan tepat, turn on pompa dan secara perlahan
naikkan laju aliran pada level yang diinginkan. Tunggu sekitar 15-20 detik antara tiap
kenaikkan dalam pengaturan aliran. Bila aliran telah di-set, tunggu paling tidak 15 menit
agar kolom menyesuaikan dengan pelarut yang baru sebelum menginjeksikan
sampel.Bila aliran pelarut diubah pada saat running, misal dari 0,8 ke 1,2 mL/menit,
lakukan pengaturan ke aliran yang baru dengan perlahan dan tunggu 5-10 menit hingga
stabil.Jika aliran pelarut harus dihentikan, kurangi thumbwheel setting dengan
perlahan ke angka nol, dan switch off pompa. Pada saat ini, pelarut dapat diubah ke
pilihan selanjutnya.Melakukan Injeksi : Semua volume injeksi yang akan dilakukan
adalah 10L. Bilas syringe beberapa kali dengan pelarut dan sampel sebelum
mengambil 10L aliquot. Pastikan tidak terdapat gelembung udara dalam tabung
syringe yang mungkin masuk. Putar katup injeksi ke load, putar retaining arm
kebawah untuk melepas plug stopper dan cabut plug. Masukkan jarum syringe ke dalam
injection loop dan injeksikan larutan. Kembalikan plug, putar retaining arm untuk
mengencangkan plug, dan selesaikan injeksi dengan cara memutar katup ke posisi
inject. Pencatat (recorder) akan start secara otomatis.
Pengaturan recorder : Menggunakan Shimadzu recorder. Atur speed pada 5, dan
attenuation pada 3.
Shut-down procedure : Pada saat kromatogram terakhir telah terekam kolom
sebaiknya dikembalikan ke kondisi yang sesuai untuk storing, yang mana ini berarti
kolom harus disiram dengan 50/50 MeOH/air pada 1 mL/menit selama sekitar 20-30
menit dan kemudian laju aliran dikembalikan ke nol. Maka ganti dengan pelarut ini
dengan mengguankan prosedur sebelumnya dan lakukan seperi diatas.

V.

ANALISA PERCOBAAN

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ( KCKT ) atau HPLC adalah metode pemisahan
komponen dalam larutan berdasarkan ukuran dan polaritas molekulnya. Fase gerak
dalam percobaan ini adalah etanol dan aquadest, sedangkan fase diamnya adalah kolom.
Dengan langkah kerja dapat dilihat pada jobsheet kimia analitik instrument, Politeknik
Negeri Sriwijaya.
Dalam percobaan ini, aliran kolom dalam fase gerak yang diinginkan dengan flow 1
ml / menit dan kami menggunakan 2 sampel yaitu kafein 1 dan kafein 2.

Pada penentuan kadar kafein 1 deret standar yang digunakan 15 ppm, dan pada
kafein 2 dengan 50 ppm.
Dari hasil yang didapatkan pada kafein 1 dan kafein 2 diketahui bahwa waktu
retensinya 5,30 . waktu retensi yang dihasilkan menentukan jumlah atau kadar apa saja
yang terkandung dalam sampel yang digunakan. Pada sampel kafein 1 luas area sebesar
17.306 dan height mAu 137.441 sedangkan pada sampel kafein 2 memiliki luas area
56.493 dan height mAu 444.289.
Dari kedua sampel waktu retensi yang dihasilkan 5.30 yang menyebabkan dapat
diketahuinya bahwa 2 sampel tersebut berasal dari sampel kafein dan kadar yang
terkandung didalamnya sama meskipun dengan konsentrasi ppm yang berbeda

VI.

KESIMPULAN

Dari percobaan yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa ;

1. Penentuan kadar aditif zat dalam sampel dapat menggunakan
2.
3.
4.
-

HPLC
Waktu retensi dari kafein1 dan kafein 2 yaitu 5.30
Pada kafein 15 ppm, menghasilkan ;
Height mAu=
137.441
Area mAu =
17.306
Pada kafein 50 ppm, mengahsilkan ;
Height mAu
=
444.289

- Area mAu =
56.493
5. Kepolaran dapat mempengaruhi retensi waktu.

DAFTAR PUSTAKA
____________.Kromatografi Cair Kinerja Tingi
(Jobsheet Penuntun Praktikum Kimia Analitik Instrumen, Jurusan Teknik Kimia,
Program Studi D IV Teknik Energi, Politeknik Negeri Sriwijaya, 2014 / 2015)
Diambil tanggal 20 juni 2015
____________. Kromatografi Cair Kinerja Tingi
(http://kimia analitik instrumen/HPLC (High Performance Liquid Chromatography) ~
Lansida.htm) diakses tanggal 20 juni 2015
____________. Kromatografi Cair Kinerja Tingi
(http://FAITHFUL KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (HPLC).htm) diakses
tanggal 20 juni 2015

GAMBAR ALAT

Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ( KCKT ) / HPLC