HPLC / KCKT

(High Performance Liquid Chromatography / Kromatografi

Cair Kinerja Tinggi)

PENDAHULUAN
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi atau KCKT atau biasa juga disebut
dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) dikembangkan
pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. Saat ini, KCKT
merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan
pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang,
salah satunya adalah bidang farmasi.
Kegunaan umum KCKT :
1. Pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun
2.
3.
4.
5.
6.
7.

senyawa biologis
Analisis ketidakmurnian
Analisis senyawa-senyawa tidak mudah menguap
Penentuan molekul-molekul netral ionic, maupun zwitter ion
Isolasi dan pemurnian senyawa
Pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir sama
Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah sekelumit, jumlah
banyak, dan dalam skala proses industri.

Dalam bidang farmasi, khususnya pada analisis farmasi, metode

KCKT merupakan metode yang sangat popular untuk menetapkan kadar
senyawa obat baik dalam bentuk sediaan atau dalam sampel hayati. Hal ini
disebabkan KCKT merupakan metode yang memberikan sensitifitas dan
spesifisitas yang tinggi.

INSTRUMENTASI PADA KCKT

Instrumentasi pada KCKT pada dasarnya terdiri atas : wadah fase
gerak, pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom,
detector, wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau
integrator atau perekam. Diagram skematik sistem kromatografi cair
ditunjukkan dalam gambar di bawah ini :

Gambar 1. Sistem peralatan KCKT secara umum

1. Wadah Fase Gerak dan Fase Gerak

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert/tidak bereaksi
dengan isi wadah). Wadah pelarut kosong atau labu laboratorium dapat
digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat
menampung fase gerak antara 1-2 liter pelarut.
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang
dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan
resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan
pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel.

Fase gerak harus disaring terlebih dahulu sebelum digunakan untuk

menhindari partikel-partikel kecil. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak
juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan
komponen lain terutama di pompa dan detector akan mengacaukan hasil
analisis.
2. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang
mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut, yakni: pompa
harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa
adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang
digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan
mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk
tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase
gerak dengan kecepatan 20 mL/menit
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak
adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung
secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis
pompa dalam KCKT yaitu : pompa dengan tekanan konstan, dan pompa
dengan aliran fase gerak yang konstan.
3. Injektor/Tempat Penyuntikan Sampel
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam
fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan
alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup Teflon
yang dilengkapi dengan keluk sampel (loop sample) internal, dan eksternal

Gambar 2. Posisi keluk sampel (loop sample) pada keadaan (a) Load/Memasukkan
Sampel, dan (b) injeksi sampel ke kolom

4. Kolom
Ada 2 jenis kolom pada KCKT yaitu kolom konvensional dan kolom
mikrobor. Kolom merupakan bagian KCKT yang mana terdapat fase diam
untuk berlangsungnya proses pemisahan solute/analit.
Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibandingkan
kolom konvensional, yakni :

Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih

kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom
mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10-100

mikroliter/menit)
Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom

mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.

Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solute lebih
pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah
sampel terbatas missal sampel klinis.

Kebanyakan fase diam pada KCKT berupa silica yang dimodifikasi

secara kimiawi, silica yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren
dan divinil benzene. Permukaan silica adalah polar dan sedikit asam
karena adanya residu gugus silanol (Si-OH)
Oktadesil silica (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling
sering digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan
kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil
yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solute yang polar, silica-silika
aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silica
yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan
waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air
yang digunakan.

5. Detektor
Detektor pada KCKT dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu :
detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak
bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias
dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik
yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti
detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai
berikut :
a. Mempunyai

respon

terhadap

solute

yang

cepat

dan

reprodusibel
b. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yaitu mampu mendeteksi
solute pada kadar yang sangat kecil
c. Stabil dalam pengoperasiannya
d. Mempunyai sel volume yang kecil
meminimalkan pelebaran pita

sehingga

mampu

e. Sinyal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi

solute pada kisaran yang luar (kisaran dinamis linier)
f. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase
gerak
6. Komputer, Integrator, atau Rekorder
Alat pengumpul data seperti computer, integrator, atau rekorder,
dihubungkan dengan detektor. Alat ini akan mengukur sinyal elektronik
yang dihasilkan oleh detektor lalu mem-plotkannya sebagai suatu
kromatogram yang selanjutnya dapat dievaluasi oleh seorang analis
Rekorder saat ini jarang digunakan karena rekorder tidak dapat
mengintegrasikan data, sementara itu baik integrator maupun
komputer

mampu

kromatogram.

mengintegrasikan

Komputer

mempunyai

puncak-puncak
keuntungan

lebih

dalam
karena

komputer secara elektronik mampu menyimpan kromatogram untuk

evaluasi di kemudian hari
INTERPRETASI DATA KROMATOGRAM HPLC
Cara menginterpretasi data kromatogram dari HPLC dilakukan dengan
dua cara :
1. Dengan penentuan waktu retensi
2. Dengan penentuan berdasarkan luas dan tinggi puncak
Waktu retensi/Retention time (Rt) adalah sinyal yang diterima dari
detektor yang menunjukkan waktu suatu senyawa terelusi (untuk analisis
kualitatif) dan jumlah sampel yang terpisah (untuk analisis kuantitatif)

Gambar 3. Contoh interpretasi data kromatogram HPLC untuk penentuan waktu

retensi dari senyawa A dan senyawa B

Gambar di atas menjelaskan kepada kita bahwa terdapat dua

senyawa yang berhasil dipisah setelah dibiarkan terelusi selama +/- 15 menit.
Senyawa A terpisah sekitar menit ke-5, kemudian senyawa B baru terpisah
pada menit ke-15.
Interpretasi kromatogram dengan menggunakan penentuan waktu
retensi, biasanya digunakan untuk mengidentifikasi sediaan farmasi yang
beredar di pasaran dan dibandingkan dengan senyawa baku-nya, contohnya
tablet Paracetamol.
Sedangkan untuk interpretasi kromatogram dengan menentukan luas
dan tinggi puncak biasa digunakan untuk menentukan jumlah sampel yang
terpisah. Biasanya, nilai pasti dari luas dan tinggi dari puncak sudah
ditampilkan secara otomatis di komputer. Jadi, tidak susah lagi dalam
mengukur tinggi dan luas puncaknya.

A
B
C
D

Gambar 4. Contoh interpretasi data kromatogram HPLC untuk penentuan tinggi dan
luas puncak

Dibawah

ini

merupakan

contoh

analisis

dari

sampel

Asetaminofen

menggunakan instrument HPLC :

Acetaminophen (USP 32)
Fase gerak

= Metanol : Air (1:3)

Larutan standar

= Buatlah 0,01 mg/mL Asetaminofen dalam fase gerak

Sistem Kromatografi =
Mode

: LC

Detektor

: UV pada panjang gelombang 243 nm

Kolom

: L1 ukuran 3,9-mm x 30-cm

Laju alir

: 1,5 mL/menit

Volume injeksi

: 10 L

REFERENSI
1. Gandjar, Ibnu Gholib. 2012. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar :
Yogyakarta.
2. Rohman, Abdul. 2009. Kromatografi untuk Analisis Obat. Graha Ilmu :
Yogyakarta.
3. Agilent Technologies. HPLC Basics

: Fundamentals of Liquid

Chromatography (HPLC). Agilent Technologies Inc : California, USA.