Oleh : Definingsih Yuliastuti

 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) biasa disebut

HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
dikembangkan pd tahun 1960-an dan awal tahun 1970-
an
 HPLC merupakan teknik pemisahan berdasarkan pada
fase diam dan fase gerak, teknik pemisahan yg diterima
secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa
tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang,
antara lain: farmasi, lingkungan, bioteknologi, industri
makanan.
1. Pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun
senyawa biologis;
2. Analisis ketidakmurnian (impurities);
3. Analisis senyawa–senyawa tidak menguap;
4. Penentuan molekul-molekul netral, ionik, maupun zwitter
ion;
5. Isolasi dan pemurnian senyawa;
6. Pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir
sama;
7. Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah sekelumit
(trace elements), dalam jumlah banyak, dan dalam skala
proses indutri.
1. Menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu
seperti asam-asam amino, protein-protein dalam
cairan fisiologis;
2. Menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat,
produk hasil samping proses sintesis, atau produk-
produk degradasi dalam sediaan farmasi;
3. Memonitor sampel-sampel yang berasal dari
lingkungan;
4. Memurnikan senyawa dalam suatu campuran;
 Sulit untuk identifikasi senyawa, kecuali jika KCKT
dihubungkan dg spektrometer massa (MS)
 Jika sampel sangat kompleks, maka resolusi yg baik
sulit diperoleh
 Kromatografi merupakan teknik yg mana solut atau zat
terlarut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi,
dikarenakan solut2 ini melewati suatu kolom
kromatografi
 Pemisahan solut diatur oleh distribusi solut dalam fase
gerak dan fase diam
 Instrumentasi KCKT pada dasarnya terdiri atas delapan
komponen pokok, yaitu :
(1) wadah fase gerak,
(2) sistem penghantaran fase gerak,
(3) alat untuk memasukkan sampel,
(4) kolom,
(5) detektor,
(6) wadah penampung buangan fase gerak,
(7) tabung penghubung, dan
(8) suatu komputer atau integrator atau perekam.
 Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert)
 Biasanya dpt menampung fase gerak antara 1-2 liter
pelarut.
 Fase gerak sblm digunakan harus dilakukan degassing
(penghilangan gas) yg ada pd fase gerak, adanya gas
akan berkumpul dg komponen lain terutama di pompa
dan detektor shg akan mengacaukan analisis.
 Saat membuat pelarut sbg fase gerak, sgt dianjurkan
menggunakan pelarut, buffer, dan reagen dg
kemurnian sgt tinggi dan berderajat KCKT (HPLC grade)
 Fase gerak sebelum digunakan harus disaring dahulu
untuk menghindari partikel2 kecil
 Adanya partikel kecil dpt berkumpul dalam kolom
sehingga dapat menyumbat kolom kromatografi
 Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran
pelarut yg dpt bercampur secara keseluruhan berperan
dlm daya elusi dan resolusi
 Daya elusi dan resolusi ditentukan oleh polaritas
keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat
komponen sampel
 Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase
gerak), kemampuan elusi meningkat dg meningkatnya
polaritas pelarut

 Untuk fase terbalik (fase diam kurang polar dari pada

fase gerak), kemampuan elusi menurun dg
meningkatnya polaritas pelarut.
 Elusi dpt digunakan dg cara isokratik (komposisi fase
gerak tetap sama selama elusi) atau dg cara bergradien
(komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi)

 Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan

resolusi campuran yg kompleks terutama jika sampel
mempunyai polaritas yg luas

 Fase gerak yg paling sering digunakan untuk

pemisahan dg fase terbalik adalah campuran larutan
buffer dg metanol atau campuran air dg asetonitril
 Syarat pompa pada KCKT : inert terhadap fase gerak.
 Bahan yg umum digunakan sbg pompa : gelas, baja
tahan karat, teflon, dan batu nilam
 Sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000
psi dan mampu mengalirkan fase gerak dg kecepatan
20 ml/menit.
 Tujuan penggunaan pompa : untuk menjamin proses
penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat,
reprodusibel, konstan dan bebas dari gangguan.
 Ada 2 jenis pompa :
1. Pompa dg tekanan konstan
2. Pompa dg aliran fase gerak yg konstan (lebih umum
digunakan)
 Sampel-sampel cair dan larutan disuntikan secara
langsung kedalam fase gerak yg mengalir dibawah
tekanan menuju kolom

 Menggunakan alat penyuntik yg terbuat dari tembaga

tahan karat dan katup teplon yg dilengkapi dg lekuk
sampel (sample loop) internal dan eksternal

 Pada saat pengisian sampel, sampel digelontor

melewati lekuk sampel dan kelebihan dikeluarkan ke
pembuang
 Ada 2 jenis kolom pada KCKT, yaitu : kolom
konvensional dan kolom mikrobor
3 Keuntungan utama kolom mikrobor dibandingkan
kolom konvensional :
 Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau
lebih kecil dibandingkan kolom konvensional, krn pd
kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih
lambat (10-100µl/menit)
 Adanya aliran fase gerak yg lebih lambat membuat
kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dg
spektrofotometer massa
 Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan krn solut
lebih pekat, krn jenis kolom ini sgt bermanfaat jika
jumlah sampel terbatas misal sampel klinis
 Kebanyakan fase diam KCKT berupa silika yg
dimodifikasi secara kimiawi, silika yg tdk dimodifikasi
atau polimer stiren dan divinil benzen

 Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena

adanya residu gugus silanol (Si-OH)
 Silika dpt dimodifikasi secara kimiawi dg reagen2 spt
klorosilan
 Silika yg dimodifikasi mempunyai karakteristik
kromatografik dan selesktifitas yg berbeda jika
dibandingkan dg silika yg tdk dimodifikasi

 Silkika yg tdk dimodifikasi akan memberikan waktu

retensi yg bervariasi disebabkan adanya kandungan air
yg digunakan
 Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yg
paling banyak digunakan krn mampu memisahkan
senyawa2 dg kepolaran yg rendah, sedang , maupun
tinggi
 Solut yg polar, terutama yg bersifat basa akan
memberikan puncak yg mengekor (tailing peak) pd
penggunaan fase diam silika fase terikat
 Dikelompokkan menjadi 2 :
1. Detektor universal (mampu mendeteksi zat secara
umum, tdk bersifat spesifik, dan tdk bersifat selektif)
ex : detektor indeks bias dan spektrofotometri massa
2. Detektor spesifik, hanya mendeteksi analit secara
spesifik dan selektif, ex : detektor UV-VIS,
fluoresensi, dan elektrokimia
 Metode KCKT merupakan metode yg sangat populer
untuk menetapkan kadar senyawa obat baik dalam
bentuk sediaan atau dalam sampel hayati.

 Hal ini disebabkan karena KCKT merupakan metode

yang memberikan sensitifitas dan spesifisitas yang
tinggi.
TERIMA KASIH…..