HPLC (High Perfomance Liquid Chromatografi)

(Tugas Makalah Instrumentasi Kimia)

Oleh

ARIK IRAWAN (1927011006)

DENIS PRASETYA (1927011002)
TIKA DWI FEBRIYANTI (1927011004)

PROGRAM PASCASARJANA MAGISTER KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS LAMPUNG
2019
 I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Secara umum, anion dan kation selalu dipisahkan dan dideteksi secara terpisah
dengan menggunakan sistem analisis yang terpisah (different systems) pula. Padahal
sangat penting dilakukan pendeteksian secara serempak(simultaneous) antara anion
dan kation dalam sekali injeksi (injection) untuk sebuah contoh sampel. Beberapa
kelebihan pendeteksian secara serempak di antaranya dapat menekan biaya
operasional (operational cost), memperkecil jumlah limbah (waste) saat analisis
berlangsung, memperpendek waktu analisis (short time analysis) serta dapat
memaksimalkan hasil yang diinginkan.

Selama ini,semua teknik yang digunakanbaik yang konvensional ataupun klasik

mempunyai pendeteksian yang terbatas (limited detection), memberikan keakuratan
hasil analisis yang rendahserta membutuhkan waktu yang lama untuk menentukan
konsentrasi suatu ion tertentu dalam sampel. Dikatakan lama karena pendeteksiannya
dilakukan dengan sistem per ion/logam.

Untuk mengatasi hal tersebut maka dibutuhkan teknik pemisahan yang memiliki
tingkat efektifitas dan keberhasilan yang tinggi. Akhir-akhir ini, untuk pemurnian
(misalnya untuk keperluan sintesis) senyawa organik skala besar, teknik kromatografi
HPLC (High Performance Liquid Chromatography) lebih sering digunakan. Beberapa
kelebihan yang dimiliki kromatografi HPLC sehingga menjadikan-nyasebagai “the
best choice” dalam dunia penentuan/pemisahan ion.
HPLC merupakan perangkat peralatan yang penting dalam perkembangan dunia
analisis bahan baku maupun bahan pencemar. Fungsi utama HPC pada dasrnya
adalah kemampuannya dalam memisahkan berbagai komponen penyusun dalam
suatu sampel. Kinerja tinggi dari kromatografi pada awalnya ditentukan oleh
ketinggian tekanannya, namun perkembangan teknologi telah menghasilkan produk
kromatografi cair berkinerja tinggi dengan tekanan yang tidak teralu tinggi.

HPLC adalah kromatografi cair kolom modern, yang dasarnya merupakan

pengembangan dari kromatografi kolom menjadi suatu sistem pemisahan yang cepat
dan efisien. Peningkatan kecepatan dan efisiensi pemisahannya terkait dengan
peningkatan performa kolomnya yang menggunakan kolom dengan ukuran dimensi
dan partikel yang jauh lebih kecil dari kolom yang dipakai pada kromatografi kolom,
sehingga agar fase gerak dapat mengalir pada kolom, fase gerak dipompa dengan
tekanan tinggi. Di samping itu, kinerja tingginya dalam analisis didukung dengan
adanya berbagai sistem deteksi dengan kepekaan tinggi yang dapat diintegrasikan
dengan sistem kromatografinya.

HPLC merupakan teknik pemisahan yang masih menjadi idola di dunia analisis saat
ini. HPLC juga digunakan secara luas dalam pemisahan dan pemurnian berbagai
sampel dalam berbagai bidang seperti farmasi, lingkungan, industri makanan dan
minuman, industri poimer, dan berbagai bahan baku lainnya. HPLC saat ini lebih
banyak digunakan untuk keperluan identifikasi (analisis kualitatif).

B. Tujuan
Tujuan dari makalah ini adalah untuk mengetahui tentang kromatografi High
Performance Liquid Chromatographi beserta aplikasinya.
 II. ISI

A. Pengetian Kromatografi

Metode kromatografi merupakan metode yang banyak digunakan dalam aplikasi

industri untuk sampel gas dan uap. Kromatografi berasal dari kata cromatography
yang bersal dari bahasa Yunani yang berarti “berwarna” karena metode ini pada
awalnya digunakan untuk pemisahan zat warna.

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola

pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa
molekul) yang berada pada larutan. Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan
melewati kolom yang merupakan fase diam. Molekul yang memiliki ikatan yang kuat
dengan kolom akan cenderung bergerak lebih lambat dibanding molekul yang
berikatan lemah. Dengan ini, berbagai macam tipe molekul dapat dipisahkan
berdasarkan pergerakan pada kolom.

Pada kolom kromatografi terdapat fasa diam yang umumnya terbuat dari material
padatan yang dapat mengabsorpsi komponen-komponen dalam sampel. Fasa diam ini
dapat berupa cairan yang melarutlkan komponen-komponen dalam sampel.
Komponen-komponen dalam sampel masuk ke dalam kolom kromatografi yang
mengandung fasa diam, dan terjadi interaksi antara komponen-komponen yang
terbawa oleh fasa gerak dan fasa diam. Interaksi ini berbeda-beda untuk masing-
masing komponen yang terdapat dalam campuran tersebut, sehingga terjadi proses
pemisahan. Setelah komponen-komponen dalam sampel terpisah, masing-masing
komponen tersebut dideteksi oleh detektor yang terdapat pada peralatan kromatografi.
Signal yang keluar dari detektor kromatografi dapat di plot terhadap waktu. Plot
signal terhadap waktu ini disebut “kromatogram”.

B. Pengertian HPLC (High Perfomance Liquid Crhomatografi)

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Performance Liquid

Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode fisikokimia berdasarkan pada
teknik kromatografi di mana fase geraknya berupa cairan dan fase diam dapat dalam
bentuk cair atau padat. Metode ini sangat bermanfaat di bidang farmasi untuk
menganalisis secara simultan beberapa analit dalam martiks sederhana maupun
kompleks.Pada akhir 1960-an, semakin banyak usaha untuk pengembangan
kromatografi cair sebagai suatu teknik untuk mengimbangi kromatografi gas. KCKT
adalah kromatografi cair kolom modern, yang dasarnya merupakan pengembangan
dari kromatografi kolom menjadi suatu sistem pemisahan yang cepat dan efisien.

Peningkatan kecepatan dan efisiensi pemisahannya terkait dengan peningkatan

performa kolomnya yang menggunakan kolom dengan ukuran dimensi dan partikel
yang jauh lebih kecil dari kolom yang dipakai pada kromatografi kolom, sehingga
agar fase gerak dapat mengalir pada kolom, fase gerak dipompa dengan tekanan
tinggi. Di samping itu, kinerja tingginya dalam analisis didukung dengan adanya
berbagai sistem deteksi dengan kepekaan tinggi yang dapat diintegrasikan dengan
sistem kromatografinya. KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi gas
(KG), keduanya dapat digunakan untuk menghasilkan efek pemisahan yang sama
baiknya. Bila derivatisasi diperlukan dalam KG, namun pada KCKT zat-zat yang
tidak diderivatisasi dapat dianalisis. Untuk zat-zat yang labil pada pemanasan atau
tidak menguap, KCKT adalah pilihan utama. Namun demikian bukan berarti KCKT
menggantikan KG, tetapi akan memainkan peranan lebih besar dalam analisis.

KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan metode kromatografi

lainnya, antara lain :
1. Cepat : waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat
diselesaikan sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang uncomplicated waktu
analisis kurang dari 5 menit bisa dicapai.
2. Resolusi tinggi : berbeda dengan KG, interaksi selektif dapat terjadi pada KCKT
karena pengaruh yang besar dari fase diam dan fase geraknya.
3. Sensitivitas detektor : detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT
dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam-
macam zat. Detektor-detektor fluoresensi dan elektrokimia dapat mendeteksi
jumlah sampai picogram (10-12 gram).
4. kolom dapat digunakan kembali : berbeda dengan kolom kromatografi klasik,
kolom KCKT dapat digunakan kembali. Banyak analisis yang bisa dilakukan
dengan kolom yang sama sehingga satu kolom dapat digunakan berulang kali
untuk berbagai jenis sampel.
5. Ideal untuk zat termolabil dan volatilitas rendah : zat-zat yang tidak bisa
dianalisis dengan KG karena terurai oleh suhu tinggi atau volatilitasnya rendah
dan dapat dianalisis secara KCKT.
6. Mekanisme pemisahan lebih variatif : banyaknya pilihan fase gerak dan fase
diam yang digunakan serta besarnya interaksi analit terhadap fase diam dan fase
gerak memungkinkan terjadinya pemisahan dengan berbagai mekanisme.
7. Mudah rekoveri sampel : umumnya detektor yang digunakan dalam KCKT tidak
menyebabkan kerusakan pada komponen sampel yang diperiksa, sehingga
komponen sampel tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah melewati
detektor.

Kromatografi cair kinerja tinggi merupakan suatu metode pemisahan canggih dalam
analisis farmasi yang dapat digunakan sebagai uji identitas, uji kemurnian dan
penetapan kadar. Titik beratnya adalah untuk analisis senyawa-senyawa yang tidak
mudah menguap dan tidak stabil pada suhu tinggi, yang tidak bisa dianalisis dengan
metode KG. Banyak senyawa yang dapat dianalisis dengan KCKT mulai dari
senyawa ion anorganik sampai senyawa organik makromolekul. Untuk analisis dan
pemisahan obat/bahan obat campuran rasemis optis aktif dikembangkan suatu fase
pemisahan kiral yang mampu menetukan rasemis dan isomer aktif. Walaupun
disadari biaya yang dibutuhkan untuk analisis dengan KCKT sangat mahal, namun
metode ini tetap dipilih untuk digunakan menganalisis 277 obat / bahan obat karena
hasil analisis yang memiliki akurasi dan presisi yang tinggi dalam waktu analisis
yang cepat.

Secara umum KCKT digunakan dalam kondisi-kondisi berikut:

1. Pemisahan berbagai senyawa organik maupun anorganik, ataupun spesimen
biologis
2. Analisis ketidakmurnian (impurities)
3. senyawa-senyawa yang tak mudah menguap (non-volatil)
4. Penentuan molekul-molekul netral, ionik maupun zwitter ion
5. Isolasi dan pemurnian senyawa
6. Pemisahan senyawa-senyawa dengan struktur kimia yang mirip
7. Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah kecil (trace elements)

C. Prinsip Dasar HPLC (High Perfomance Liquid Crhomatografi)

Prinsip dasar dari HPLC adalah memisahkan setiap komponen dalam sample untuk
selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-
masing komponen tersebut (kuantitatif). Sebetulnya hanya ada dua hal utama yang
menjadi krusial point dalam metode HPLC. Yang pertama adalah proses
separasi/pemisahan dan yang kedua adalah proses identifikasi. Dua hal ini mejadi
faktor yang sangat penting dalam keberhasilan proses analisa.

Menurut JULIA K., 1996 dalam ISMAIL HENDRA, 2007, prinsip kerja dari HPLC
adalah pemisahan absoprsi dan desorpsi yang berulang kali dari komponen yang
dipisahkan. Pada saat komponen tersebut dibawa oleh fase gerak mengalir sepanjang
kolom. Pemisahan ini terjadi karena adanya perbedaan kecepatan migrasi dari
masing-masing komponen yang didasarkan oleh adanya perbedaan koofisien
distribusi dari komponen tersebut antara kedua fasa.

HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi

kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung
melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat. HPLC
memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material
terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar
berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini
memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam
campuran. Perkembangan yang lebih luas melalui kromatografi kolom
mempertimbangkan metode pendeteksian yang dapat digunakan. Metode-metode ini
sangat otomatis dan sangat peka. HPLC berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC
menggunakan kolom dengan diameter umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran
partikel penunjang 50µm sedangkan laju aliran dipertinggi dengan tekanan yang
tinggi. Aplikasi analisis HPLC adalah untuk penentuan kualitatif dan penentuan
kuantitatif.

Prinsip dasar HPLC sebenarnya adalah dinamika dan migrasi dengan menggunakan
dua fasa. HPLC biasanya digunakan untuk senyawa untuk yang berberat molekul
tinggi dan tidak menguap, dimana penyerapan semakin baik jika molekul berada pada
bentuk terkecil sehingga pemisahan pun juga akan semakin baik. Setelah pemisahan
ini, selanjutnya diidentifikasikan secara kualitatif dan dihitung berapa konsentrasi
dari masing-masing komponen tersebut secara kuantitatif.

 Penentuan Kualitatif
HPLC digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan pada waktu retensi untuk
identifikasi. Identifikasi dapat diandalkan apabila waktu retensi sampel dibandingkan
dengan larutan standar.
 Penentuan Kuantitatif
Beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat dipergunakan untuk
penentuan secara kuantitatif adalah:
1. Parameter percobaan sama antara standar dan sampel
2. Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang sama
3. Penentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi) dengan
menggunakan larutan standar seri pada waktu retensi tertentu.
4. Berdasarkan area kromatogram
5. Berdasarkan tinggi puncak kromatogram

Umumnya hasil analisis HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam
kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis
komponen dalam sample.
Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai
kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk
(overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi.
Oleh karena itu biasanya untuk sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample
yang lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih
dari impuritis.

D. Prinsip Kerja HPLC (High Perfomance Liquid Crhomatografi)

Pada prinsipnya kerja HPLC adalah sama yaitu pemisahan analit-analit berdasarkan
kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu
sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya
adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran
analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya dan kecepatannya untuk sampai
kedektetor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spectrum yang
puncak-puncaknya terpisah. Ukuran skala polaritas : golongan fluorocarbon <
golongan hidrokarbon < senyawa terhalogenasi < golongan eter < golongan ester <
golongan keton < golongan alcohol < golongan asam.

1. Injeksi sampel
Injeksi sample seluruhnya dilakukan secara otomatis sehingga tidak bisa mengetahui
yang terjadi pada keadaan tingkat dasar. Karena proses ini meliputi tekanan, tidak
sama halnya dengan kromatografi gas.

2. Waktu retensi
Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor
disebut sebagai waktu retensi.Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana
sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum
dari senyawa itu. Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang
berbeda pula. Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan
bergantung pada:
 Tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari
pelarut).
 Kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada
ukuran partikel).
 Komposisi yang tepat dari pelarut.
 Temperatur pada kolom

3. Detector
Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode
umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-
violet.Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang
gelombang.
Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang
melewati melalui berkas pada waktu itu

4. Interpretasi output dari detector

Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing
puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap
sinar UV. Sepanjang anda mengontrol kondisi kolom,dapat menggunakan waktu
retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh

.
Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui
detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer.Area
dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).

E. Komponen Instrumen HPLC

Komponen instrumen yang sangat berperan penting dalam kinerja HPLC adalah
sebagai berikut:
a. Fasa gerak
HPLC adalah suatu teknik kromatografi yang menggunakan fasa gerak cair, dapat
digunakan untuk pemisahan sekaligus untuk analisis.
Berdasarkan kekuatan / kepolaran fasa geraknya KCKT dibagi menjadi:
1. Fasa normal : Fasa gerak kurang polar dibandingkan fasa diam
2. Fasa Terbalik : Fasa gerak lebih polar dibandingkan fasa diam

1. Fase normal HPLC

Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya
heksan. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin
kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm. Senyawa-senyawa polar
dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar
dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non
polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom.

2. Fase balik HPLC

Dalam kasus ini, ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar
melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara
sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar
digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol. Dalam kasus ini, akan
terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran
yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantai-rantai
hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-molekul polar
dalam larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan
menghabiskan waktunya untuk bergerak bersama dengan pelarut.

Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi

dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-
senyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan
ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawa-senyawa tersebut berada dalam
molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh karenanya, senyawa-senyawa ini
akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam kolom. Ini
berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom.

Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau rasa gerak adalah salah satu
dari variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi yang sangat luas pada
solven yang digunakan untuk KCKT, tetapi ada beberapa sifat umum yang sangat
disukai, yaitu rasa gerak harus :
a) Murni, tidak terdapat kontaminan
b) Tdak bereaksi dengan wadah (packing)
c) Sesuai dengan defektor
d) Melarutkan sampel
e) Memiliki visikositas rendah
f) Bila diperlukan, memudahkan “sample recovery”
g) Diperdagangan dapat diperoleh dengan harga murah (reasonable price)
Umumnya, semua solven yang sudah digunakan langsung dibuang karena prosedur
pemumiannya kembali sangat membosankan dan mahal biayanya. Dari semua
persyaratan di atas, persyaratan 1) s/d 4) merupakan yang sangat penting.
b. Pompa
Fase gerak dalam KCKT adalah suatu cairan yang bergerak melalui kolom. Ada dua
tipe pompa yang digunakan, yaitu kinerja konstan (constant pressure) dan
pemindahan konstan (constant displacement). Pemindahan konstan dapat dibagi
menjadi dua, yaitu:
 Pompa reciprocating.
Pompa reciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur (pulsating),
oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau peredam elektronik untuk
menghasilkan garis dasar (base line) detektor yang stabil, bila detektor sensitif
terhadapan aliran. Keuntungan utamanya ialah ukuran reservoir tidak terbatas.
 Pompa syringe
Memberikan aliran yang tidak berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas.

c. Injektor (injector)
Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan disturbansi
yang minimum dari material kolom. Sampel yang akan dipisahkan dimasukkan ke
dalam kolom secara otomatis atau manual melalui injeksi. Volume injeksi sangat
tepat karena mempunyai sampel loop dengan variabel volume (misalnya 20 – 500
μL).
Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :
1. Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem
tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di
dalam cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi
2. Septum: Septum yang digunakan pada HPLC sama dengan yang digunakan pada
Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60-70
atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut
Kromatografi Cair. Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum
injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.
3. Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume
lebih besar dari 10 μ dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan
adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual).
Pada posisi LOAD, sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila
VALVE difungsikan, maka sampel akan masuk ke dalam kolom.
Berikut digambarkan sampel injektor pada HPLC yaitu

Keuntungan menggunakan Injektor :

 Dapat memasukkan sampel ke dalam kolom dalam bentuk sesempit mungkin
 Mudah digunakan
 Keberulangn tinggi
 Dapat bekerja walaupun ada tekanan balik
d. Kolom (Column)
Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung
pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom dapat dibagi
menjadi dua kelompok :
1. Kolom analitik : Diameter dalam 2 -6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis
material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang yang digunakan
adalah 50 -100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat, 10 -30 cm. Dewasa ini
ada yang 5 cm.
2. Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan
panjang kolom 25 -100 cm.
Kolom umumnya dibuat dari stainlesteel dan biasanya dioperasikan pada temperatur
kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama untuk
kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Pengepakan kolom tergantung
pada model HPLC yang digunakan Liquid Solid Chromatography, (LSC), Liquid
Liquid Chromatography (LLC) Ion Exchange Chromatography(IEC), Exclution
Chromatography (EC).

e. Interpretasi output dari detektor

Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing
puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap
sinar UV. Sepanjang anda mengontrol kondisi kolom, anda dapat menggunakan
waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh, tentunya,
anda (atau orang lain) sudah mengukur senyawa-senyawa murninya dari berbagai
senyawa pada kondisi yang sama. Anda juga dapat menggunakan puncak sebagai
jalan untuk mengukur kuantitas dari senyawa yang dihasilkan. Mari beranggapan
bahwa tertarik dalam senyawa tertentu, X.

Jika anda menginjeksi suatu larutan yang mengandung senyawa murni X yang telah
diketahui jumlahnya pada instrumen, anda tidak hanya dapat merekam waktu retensi
dari senyawa tersebut, tetapi anda juga dapat menghubungkan jumlah dari senyawa X
dengan puncak dari senyawa yang dihasilkan.

Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui
detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer. Area
dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana). Jika
larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan berkurang meskipun waktu retensi
akan sama. Misalnya,

Ini berarti dimungkinkan mengkalibrasi instrumen sehingga dapat digunakan untuk

mengetahu berapa jumlah substansi yang dihasilkan meskipun dalam jumlah kecil.
Meskipun demikian, harus berhati-hati. Jika anda mempunyai dua substansi yang
berbeda dalam sebuah campuran (X dan Y), dapatkah anda mengatakan jumlah
relatifnya? Anda tidak dapat mengatakannya jika anda menggunakan serapan UV
sebagai metode pendeteksinya.

Dalam gambar, area di bawah puncak Y lebih kecil dibanding dengan area dibawah
puncak X. Ini mungkin disebabkan oleh karena Y lebih sedikit dari X, tetapi dapat
sama karena Y mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang lebih sedikit
dibanding dengan X. Ini mungkin ada jumlah besar Y yang tampak, tetapi jika
diserap lemah, ini akan hanya memberikan puncak yang kecil.
F. Aplikasi dari HPLC

Aplikasi HPLC antara lain:

 HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi
dan pestisida.
 Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat
dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.
 Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang
dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori.
 Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX.
 Dapat memisahkan vitamin- vitamin yang larut dalam air.
 Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah
biokimia.
 Dapat digunakan untuk memurnikan dan mengidentifikasi suatu senyawa.

G. Kelebihan dan Kekurangan

Dengan adanya HPLC tentunya sangat membantu dalam proses kromatografi.

1. kelebihan dari alat HPLC antara lain:
 Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan daya memisah
yang tinggi.
 Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan analisis.
 Dapat digunakan bermacan-macam detektor dengan kepekaan yang tinggi.
 Kolom dapat digunakan kembali.
 Waktu analisa cukup singkat.
 HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat yang
tidak stabil.
 Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya.
 Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.
2. Kelemahan dari alat HPLC antara lain:
 Harga sebuah alat HPLC cukup mahal
 Sering ada larutan standar yang tertinggal diinjektor.
 Pada kolom dengan diameter rata-rata partikel fase diam dengan ukuran 5 dan 3
mikrometer sela-sela partikel lebih mudah tertutup oleh kotoran, jadi harus
seringkali dicuci dan kemurnian larutan harus dijaga.

Aplikasi dalam Penelitian

Judul Penelitian : Pengukuran kuantitatif terhadap alkaloid-terpenoid dalam

empat spesies Aconitum menggunakan HPLC

Penulis : Zhaohong Wang, Jiao Wen, Junbo Xing, dan Ye Hea

Tumbuhan genus Aconitum (Ranunculaceae) tersebar luas di seluruh Asia Utara dan
Amerika Utara. Disebutkan bahwa ada 167 spesies Aconitum yang tumbuh di
Tiongkok dan 44 jenis di antaranya telah digunakan dalam pengobatan tradisional
untuk mengobati nyeri rematik, kelumpuhan karena stroke, dan bisul. Akar aconitum
mengandung banyak alkaloid-diterpenoid yang memiliki sifat analgesik, antipiretik,
dan bius lokal, tetapi sangat toksik dan ada batas keselamatan yang sempit antara
dosis terapi dan toksik. Kematian akibat menelan Aconitum sering terjadi dan banyak
terjadi di Asia Timur. Di Cina sendiri, 878 kasus dilaporkan dari 1977 hingga 1985.
Karena alkaloid-diterpenoid adalah konstituen aktif dan toksik utama dalam
Aconitum, jumlahnya dapat menjadi indeks penting dalam evaluasi kualitas obat
herbal ini. Dalam makalah sebelumnya, beberapa metode kromatografi cair kinerja
tinggi (HPLC) dan metode elektroforesis kapiler telah digunakan untuk penentuan
aconitine, mesaconitine dan hypaconitine dalam bumbu dan sediaan obat Cina.
Namun, tidak satu pun dari metode ini yang mampu memisahkan alkaloid ini,
sehingga hasil kuantitatifnya tidak akurat. Sampai saat ini, belum mungkin untuk
secara simultan menentukan dan jumlah benzoylmesaconine, mesaconitine, aconitine,
hypaconitine dan deoxyaconitine dalam Aconitum spp. Metode HPLC sederhana
disajikan untuk kuantifikasi lima alkaloid utama dalam empat spesies Aconitum,
yang sebagian besar sering digunakan dalam pengobatan tradisional Tiongkok.

Percobaan

Bahan
Dalam penelitian ini digunakan standar sampel mesaconitine (2), aconitine (3) dan
hypaconitine (4) diperoleh dari National Institute for Control of Pharmaceuticals and
Biological Products (Beijing, PR China). Benzoylmesaconine (1) dan deoxyaconitine
(5) dibuat dari Aconitum carmichaeli Debx di laboratorium (dengan ekstraksi, fraksi
kromatografi dan kristalisasi, kemurnian 99,5%).

Peralatan dan Kondisi HPLC

Dalam penelitian ini digunakan peralatan HPLC Waters, dengan pompa 600E, AF-
inline degasser, 717-plus autosampler dan detektor PDA 996. Kolom yang digunakan
adalah kolom XTerraTM RP18 (250 mm × 4.6mm i.d., 5mm) dengan kolom pelindung
dengan dimensi (20 mm × 3.0 mm) dengan packing yang sama. Eluen yang
digunakan adalah eluen A (0.03M amonium hidrogen karbonat,dalam air dan diatur
hingga pH 9.5 menggunakan amonia pekat) dan eluen B (100% asetonitril).
Elusi dilakukan secara gradien dari eluen A dan B (menit ke 0 = 70:30, menit ke 40 =
62:38, menit ke 60 = 55:45, v/v) dengan kecepatan alir sebesar 1 mL/menit. Setiap
sampel diinjeksi sebanyak 10 mL dan dimonitor pada panjang gelombang 233 nm
dan direkam pada panjang gelombang antara 200 dan 300 nm. Temperatur kolom
yang digunakan pada saat elusi sebesar 35oC. Senyawa diidentifikasi berdasarkan
perbandingan waktu retensi dari analit dengan sampel stndar.

Preparasi Sampel
Sampel serbuk (100 mesh, 0,1 g) diekstraksi tiga kali dengan 0,2M HCl (2 ml)
menggunakan ultrasonik batch pada suhu kamar selama 30 menit. Fase cair disaring
dan residu dicuci dua kali dengan 0,2M HCl (1 ml). Fase cair digabungkan dan
dimuat ke kartrid ekstraksi Oasis®MCX yang sebelumnya dikondisikan dengan
metanol 3ml dan air 3ml. Setelah mencuci cartridge dengan 3ml 0,1M HCl, 1ml
metanol dan 3ml 1% NH4OH secara berturut-turut, alkaloid dielusi dengan larutan 3
ml yang mengandung 5% trietilamina dalam metanol. Eluat dikeringkan di bawah
nitrogen pada 35 ◦C dan residu didasari dengan 1 ml 0,1M HCl. Larutan yang
diperoleh sebelumnya disaring melalui filter membran (0,45 mm) untuk injeksi.

Studi Linieritas

Untuk larutan standar, senyawa referensi 1 (5,3 mg), 2 (4,7 mg), 3 (4,9 mg), 4 (6,5
mg) dan 5 (5,1 mg) dilarutkan dalam aktonitril dan diencerkan dengan 0,1M HCl
untuk memberikan lima konsentrasi berbeda . Setiap konsentrasi dianalisis lima kali
menggunakan kondisi HPLC yang sama seperti yang dijelaskan di atas.

Hasil dan Pembahasan

Optimasi Kondisi Pemisahan

Pemilihan kondisi dilakukan menggunakan metode trial and error untuk

mendapatkan kromatogram dengan resolusi yang lebih baik dari puncak yang
berdekatan dengan waktu analisis yang singkat, terutama ketika banyak sampel yang
mirip akan dianalisis.

Pada awalnya, berbagai campuran eluen metanol-air-kloroform-trietilamin, asam

trifluoroasetat-tetrahidrofuran 0,1% dan metanol-air-asetonitril digunakan sebagai
fase gerak tetapi pemisahannya tidak memuaskan. Buffer asetonitril dan amonium
hidrogen karbonat kemudian dipilih sebagai fase gerak karena alkaloid dapat
dipisahkan jauh lebih baik dalam kondisi ini. Pemisahan yang lebih baik juga terjadi
dengan pemanasan kolom pada suhu 35 ◦C.

Meskipun kelima alkaloid dapat dipisahkan dengan elusi HPLC isokratis (A: B,
50:50, v/v), menurut spektra serapan UV, selain lima senyawa yang diketahui,
sebagian besar puncak lainnya pada kromatogram juga merupakan jenis lain dari
alkaloid Aconitum; gradien elusi dilakukan untuk mendapatkan kromatogram yang
baik untuk semua alkaloid yang terkandung dalam obat-obatan mentah dan dapat
menggunakan kondisi percobaan yang sama untuk mempelajari lebih lanjut
fingerprint alkaloid Aconitum.

Persamaan Regresi

Dari Tabel 1. Dapat terlihat bahwa kelima alkaloid memberikan regresi linier yang
baik dengan g = 0.9999 dengan rentang konsentrasi yang relatif luas. Rentang limit
deteksi dari 15-30 ng/mL dideteksi pada 233 nm.

Uji Kesesuaian Sistem

Pengujian recovery lima alkaloid dilakukan dengan menambahkan standar pada

serbuk herbal, yang diperlakukan sesuai dengan prosedur yang dijelaskan dalam
Bagian 2.3. Pemulihan rata-rata untuk alkaloid adalah 94,6-101,9% (lihat Tabel 2).
Tes presisi dilakukan dengan menyuntikkan larutan sampel yang sama lima kali, dan
hasilnya menunjukkan bahwa standar deviasi relatif (R.S.D.) area puncak masing-
masing alkaloid adalah 0,14-0,67%.
Untuk uji stabilitas, solusi sampel yang sama dianalisis setiap 12 jam dalam 2 hari,
dan analit teramati lebih stabil dalam waktu 48 jam (R.S.D. <0,98%).

Aplikasi

Gambar 1. Kromatogram dari (a) standar sampel, (b) Aconitum carmichaeli, (c)
Aconitum pendulum (d) Aconitum hemsleyanum, dan (e) Aconitum transseltum.
Benzoylmesaconine (BMA), mesaconitine (MA), aconitine (AC), hypaconitine (HA),
deoxyaconitine (DA).

Dari Gambar 1 terlihat bahwa waktu retensi dari parameter 1 (BMA), 2 (MA), 3
(AC), 4 (HA), dan 5 (DA) secara berurutan adalah 10.23, 31.98, 46.97, 49.20 dan
63.26 menit. Pengukuran kandungan alkaloid di dalam sampel terlihat pada Tabel 3.

Data pada Tabel 3 menunjukkan bahwa kandungan lima alkaloid yang ditentukan
dalam Aconitum sangat bervariasi dari satu spesies ke spesies lainnya. Karena
alkaloid adalah metabolit sekunder yang memiliki aktivitas biologis penting dan
senyawa toksik utama Aconitum spp., Diindikasikan bahwa kualitas obat-obatan
mentah ini dapat bervariasi secara signifikan. Ini mungkin salah satu alasan paling
utama mengapa kematian akibat menelan obat-obatan Aconitum sering terjadi.
 III. KESIMPULAN

Adapun kesimpulan yang didapat dari makalah ini adalah sebagai berikut:

1. HPLC merupakan alat yang dapat diandalkan dalam pemisahan dan pemurnian
senyawa organik dengan resolusi pemisahan yang tinggi dengan waktu
pengoprasian yang lebih singkat
2. HPLC dapat digunakan dalam penentuan kadar senyawa organik didalam suatu
sampel yang kompleks seperti kandungan alkaloid dalam Aconitum spp.