LAPORAN PRAKTIKUM ANALISIS BIOMOLEKULAR

ACARA VI
SDS-PAGE

Disusun oleh:

Nama : Wahyuni Wulansari

NIM : 1611201004
Kelompok :3
Hari/Tanggal :
Fakultas : Sains dan Teknologi
Program Studi : Bioteknologi

PROGRAM STUDI S1-BIOTEKNOLOGI

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS ‘AISYIYAH
YOGYAKARTA
2017
 ACARA V
SDS-PAGE

I. TUJUAN
1. Mengetahui tehnik pemisahan protein berdasarkan berat molekul dengan
menggunakan SDS-PAGE.

II. DASAR TEORI

SDS PAGE adalah metode yang dapat diandalkan untuk menentukan berat molekul
dari protein yang tidak diketahui, karena tingkat migrasi dari protein dilapisi dengan SDS
berbanding terbalik dengan logaritma dari berat molekul. SDS PAGE dinilai lebih
menguntungkan disebabkan karena besarnya pori gel, serta perbandingan konsentrasi
akrilamida dan bis-metilen akrilamida, oleh sebab itu gel poliakrilamida dapat digunakan
tidak hanya untuk pemisahan dari berbagai protein, tetapi juga untuk membandingkan berat
molekulnya (Bintang, 2010). Kunci untuk menentukan berat molekul yang akurat adalah
memilih kondisi pemisahan yang menghasilkan hubungan linier antara logaritma dari berat
molekul dan migrasi protein (BioRad, 2011). Migrasi protein di dalam gel poliakrilamida
terutama ditentukan oleh muatan molekul dan juga dipengaruhi oleh ukuran molekul
(Bintang, 2010). Protein yang dipisahkan dengan SDS-PAGE dapat dikarakterisasi
berdasarkan berat molekulnya dengan satuan Kilo Dalton (kDa). Satu dalton sama dengan
satu hidrogen molekul (Bachrudin, 2000).
Rachmania et al., ALCHEMY Jurnal Penelitian Kimia, Vol. 13 (2017), No. 1 , Hal. 52 - 65 52
PROFIL BERAT MOLEKUL ENZIM PROTEASE BUAH NANAS (Ananas comosus L.Merr) DAN PEPAYA
(Carica papaya L.) MENGGUNAKAN METODE SDS-PAGE MOLECULAR WEIGHT PROFILE OF
PROTEASE OF PINEAPPLE (Ananas comosus L.Merr) AND PAPAYA (Carica papaya L.) USING SDS-
PAGE METHOD Rizky Arcinthya Rachmaniaa*, Priyo Wahyudib, Aniza Mutia Wardania, Dini
Rohmatul Insania

Sedangkan pengertian SDS menurut Dharmawati (1995) adalah detergen yang

mempunyai muatan negatif yang sangat besar sehingga SDS akan mengikat muatan positif
dari protein dan dengan demikian mengakibatkan pergerakan protein kearah elektroda positif.
Teknik ini telah terbukti mampu mendeteksi fraksi protein dalam konsentrasi kecil.
PENGGUNAAN SDS-PAGE UNTUK KARAKTERISASI FRAKSI PROTEIN SEBAGAI ALTERNATIF METODE IDENTIFIKASI
PENCAMPURAN DAGING BABI KE DALAM BAKSO Edy Susanto JURNAL TERNAK Vol. 01 No.01 Th.2010

Metode ini merupakan metode yang banyak digunakan. Pada penelitian ini digunakan 2 jenis
gel, yaitu gel penahan (stacking gel) dan gel pemisah (separating gel). Gel tersebut mengandung
akrilamida, sodium dodesil sulfat (SDS), amonium persulfat (APS) dan TEMED. Gel akrilamid
diperoleh dengan cara polimerisasi akrilamida dengan sejumlah crosslinking agent metilen bis
akrilamid dan ammonium persulfat (APS) sebagai katalisator. Radikal bebas yang terbentuk dari
pelarutan APS dalam air akan bereaksi dengan akrilamid membentuk akrilamid aktif yang dapat
bereaksi satu dengan yang lain membentuk polimer. Penambahan SDS bertujuan agar bagian hidrofob
dari molekul protein terikat dengan SDS sehingga molekul terurai dari lipatannya. Dengan demikian
proses pemisahan protein hanya berdasarkan perbedaan bobot molekul. Disamping itu ke dalam
buffer sampel ditambahkan agen pereduksi yaitu beta-mercaptoetanol untuk memutuskan ikatan
disulfida dari protein. Pada proses elektroforesis molekul protein yang berukuran kecil akan bergerak
lebih cepat melintasi gel, sedangkan molekul protein yang berukuran besar akan bergerak lebih
lambat. Pada akhirnya protein dengan berat molekul yang rendah akan mempunyai Rf (jarak tempuh)
yang lebih tinggi dibandingkan dengan yang berukuran lebih besar.

Analisis Profil Protein Dan Asam Amino Sarang Burung Walet

(Collocalia Fuchiphaga) Asal Painan Analysis on Protein Profile and Amino
acid of Bird Nest of Burung Walet (Collocalia Fuchiphaga) from Painan Lina Elfita
Jurnal Sains Farmasi & Klinis, 1(1), 27-37

SDS-PAGE merupakan teknik untuk memisahkan protein berdasarkan arus listrik, yang
merupakan fungsi dari panjang rantai polipeptida atau berat molekulnya, hal ini dilakukan dengan
cara menambahkan deterjen SDS dan pemanasan untuk merusak struktur tiga dimensi pada protein
dengan terpecahnya ikatan disulfide yang selanjutnya direduksi menjadi gugus sulfidhihidril.
PHPI 2015, Volume 18 Nomor 2 Masyarakat Pengolahan Hasil Perikanan Indonesia Deteksi Ikan Tuna dan
Produk Olahannya, Wulansari et al. DETEKSI IKAN TUNA DAN PRODUK OLAHANNYA
BERBASIS PROTEIN DAN DNA BARCODING Detection Tuna and Processed Products Based
Protein and DNA Barcoding Nuring Wulansari1*, Mala Nurilmala2, Nurjanah2

Pita protein dengan intensitas lebih tebal memiliki konsentrasi lebih tinggi.
Selanjutnya, menurut Cahyarini et al. (2004) tentang perbedaan tebal tipis pita protein
disebabkan karena perbedaan jumlah molekul termigrasi. Pita dengan muatan ionik lebih
besar akan termigrasi lebih jauh daripada pita bermuatan ionik lebih kecil (Sinlae,2015).

Karakteristik Protein Plasma Sapi Bali(CHARACTERISTICS OF BALI CATTLE

PLASMA PROTEINS)Wahyu Tri Utomo1, I Nyoman Suarsana2,I Gusti Ayu Agung Suartini jurnal Veteriner Juni
2017 Vol. 18 No. 2 :

III. ALAT DAN BAHAN

Alat yang digunakan dalam praktikum SDS-PAGE adalah Plate SDS-

PAGE,Perangkat SDS-PAGE,Mikropipet,Tip,dan Power Supply. Untuk bahan yang
digunakan membuat stacking gel yaitu H2O 0,68 ml,Acrilamide-Bisacrylamide-Mix 30%
0,17 ml, 0,5 Tris-HCL pH 6,8 0,125 ml,10% SDS 0,01 ml,10 % APS 0,01 ml,TEMED 1.0 µl.

Untuk bahan separating gel 12 % yaitu H2O 0,33 ml, Acrilamide-Bisacrylamide-

Mix 30% 0,4 ml, 0,5 Tris-HCL pH 8,8 0,25 ml, 10% SDS 0,01 ml,10 % APS 0,01
ml,TEMED 0.5 µl. Untuk bahan separating gel 10 % yaitu H2O 0,4 ml, Acrilamide-
Bisacrylamide-Mix 30% 0,33 ml, 0,5 Tris-HCL pH 8,8 0,25 ml, 10% SDS 0,01 ml,10 % APS
0,01 ml,TEMED 0.5 µl.
IV. CARA KERJA

SDS-PAGE

Gel Polyacrilamide dibuat dengan konsentrasi separating gel 12% dan

lkjckjjjs
stacking gel 4% dengan komposisi sesuai dengan bahan diatas.

Casting gel dilakukan sesuai instruksi asisten praktikum dan alat

elektroforesis dirakit setelah gel menjendal.

Page Buffer dituang ke inner chamber,sisir diambil dan kemudian sample

dimasukkan sesuai dengan urutan

Gen dirunning dengan voltase 60V selama 20 menit,kemudian dilanjutkan

dengan voltase 150V sampai tracking dye front hilang dari gel.

Gel diambil dan dilakukan pewarnaan dengan coomasie blue selama 5 kali
dengan menggunakan oven hingga warna gel yang pekat menjadi lebih
pudar.

Hasil SDS-PAGE di dokumentasikan.

 V. HASIL PENGAMATAN

VI. PEMBAHASAN

SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) merupakan

metode yang digunakan untuk memisahkan protein berdasarkan ukuran berat molekulnya
(Davidson.org, , 2003). Sedangkan pengertian SDS adalah detergen yang mempunyai muatan
negatif yang sangat besar sehingga SDS akan mengikat muatan positif dari protein dan
dengan demikian mengakibatkan pergerakan protein kearah elektroda positif. Teknik ini telah
terbukti mampu mendeteksi fraksi protein dalam konsentrasi kecil. Migrasi protein di dalam
gel poliakrilamida terutama ditentukan oleh muatan molekul dan juga dipengaruhi oleh
ukuran molekul (Bintang, 2010). Protein yang dipisahkan dengan SDS-PAGE dapat
dikarakterisasi berdasarkan berat molekulnya dengan satuan Kilo Dalton (kDa). Satu dalton
sama dengan satu hidrogen molekul. Untuk bahan-bahan yang digunakan dalam SDS-PAGE
adalah SDS,gel polyacrilamide,Glycerol,Comassie Briliant Blue,APS,TEMED,dan buffer.

SDS merupakan detergen yang digunakan dalam proses SDS-PAGE,SDS berguna

untuk mengubah muatan protein menjadi negatif agar dapat terseleksi pada gel
polyacrilamide. SDS akan menyelimuti protein dengan muatan negatif,SDS juga dapat
mengubah struktur protein yang mulanya berbentuk tersier maupun kuarter menjadi protein
berbentuk primer (lurus). Acrilamide digunakan sebagai bahan baku pembuatan gel SDS-
PAGE karena memiliki pori-pori yang relatif kecil sehingga efektif digunakan untuk
mengelektroforesis protein,semakin banyak komposisi gel acrilamide maka semakin lama
SDS-PAGE akan berlangsung. Gel akrilamid diperoleh dengan cara polimerisasi akrilamida
dengan sejumlah crosslinking agent metilen bis akrilamid dan ammonium persulfat (APS)
sebagai katalisator. Radikal bebas yang terbentuk dari pelarutan APS dalam air akan bereaksi
dengan akrilamid membentuk akrilamid aktif yang dapat bereaksi satu dengan yang lain
membentuk polimer. Penambahan SDS bertujuan agar bagian hidrofob dari molekul protein
terikat dengan SDS sehingga molekul terurai dari lipatannya. Dengan demikian proses
pemisahan protein hanya berdasarkan perbedaan bobot molekul. Disamping itu ke dalam
buffer sampel ditambahkan agen pereduksi yaitu beta-mercaptoetanol untuk memutuskan
ikatan disulfida dari protein. Pada proses elektroforesis molekul protein yang berukuran kecil
akan bergerak lebih cepat melintasi gel, sedangkan molekul protein yang berukuran besar
akan bergerak lebih lambat.

Penggunaan buffer dimaksudkan agar terjadi keseimbangan pH saat melakukan SDS-

PAGE didalam buffer terdapat larutan loading dye yang terdiri bromophenol
blue,selensianol,dan gliserol. Gliserol berfungsi sebagai bahan yang digunakan untuk
membuat sample dapat tetap berada pada sumuran dan tidak bergerak ke segala arah
sedangkan bromophenol blue berguna untuk memvisualisasikan hasil SDS-PAGE.Sementara
APS dan TEMED digunakan untuk menjedalkan gel polyacrilamide.

Sample yang didapatkan berasal dari beberapa hewan dan tumbuhan,seperti laba-
laba,ulat bulu,laron,cacing dan kecoa. Untuk tumbuhan digunakan sample padi,tembakau
wild type dan tembakau mutan yang telah diutak atik gen klorofilnya. Pada SDS-PAGE
digunakan sebanyak 24 sumuran untuk bagian atas 12 sumuran dan bagian bawah 12
sumuran. Beberapa sample yang diduga marker dimasukkan ke dalam sumuran tetapi ada
salah satu yang tidak menunjukan hasil sehingga sample tersebut bukanlah marker. Pada
SDS-PAGE tedapat 2 jenis gel yang digunakan yaitu stacking dan separating gel. Perbedaan
dapat dilihat dari konsentrasi gel poliakrilamid yaitu pada stacking gel memiliki konsentrasi 5
% sedangkan separating gel memiliki konsentrasi 12 %. Stacking gel berguna agar proses
turunnya protein dalam gel bersamaan,sedangkan separating gel digunakan untuk
memisahkan protein menurut berat molekulnya. Semakin kecil berat molekul protein yang
dipisahkan, maka semakin tinggi konsentrasi gel poliakrilamid yang digunakan agar pori-pori
gel yang terbentuk semakin rapat. Pada saat arus listrik diberikan, molekul bermigrasi melalui
gel poliakrilamid dari kutub negatif (katoda) menuju kutub positif (anoda).

Beberapa kesulitan yang dialami dalam proses SDS-PAGE adalah memasukkan sample
ke dalam sumuran,karena dalam prosesnya dibutuhkan ketelitian serta kehatian-hatian dalam
memasukkan sample ke dalam sumuran. Kurangnya kehati-hatian dalam memasukkan
smaple kedalam sumuran dapat menyebabkan rusaknya sumuran yang berakibat hasil SDS-
PAGE yang tidak maksimal. Selain itu perlu diperhatikan mengenai proses isolasi protein
dari sample hewan dan sample tumbuhan,karena jika pada saat isolasi masih terdapat
kontaminan dan tidak murni protein maka hasil yang didapatkan pada saat SDS-PAGE tidak
menunjukan hasil yang kita inginkan. Kontaminan RNA ataupun DNA menyebabkan hasil
SDS-PAGE tidak akurat,selain kontaminan itu kontaminan juga dapat menyebabkan SDS-
PAGE mengalami Smear sehingga hasil SDS-PAGE tidak bisa dibaca.