LAPORAN PRAKTIKUM FITOKIMIA

PENENTUAN KADAR PARACETAMOL MENGGUNAKAN METODE

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)

Dosen pengampuh : Apt. Yuli Nurullaili, M. Farm.

Disusun Oleh :

Anisa Fitri (34180224)

Darna (34180229)

Devi Mia Viola (34180231)

Eny Wijayanti (34180237)

LABORATORIUM FITOKIMIA

PRODI D III FARMASI STIKES SURYA GLOBAL

YOGYAKARTA

2020
DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ………………………………………………………………………

DAFTAR ISI…………………………………………….……………………………………

A. TUJUAN …… …….…………………………….……………………………………

B. PENDAHULUAN……...……………………………………………………………..

C. ALAT DAN BAHAN………………………………………………………………….

D. CARA KERJA…………………………………………………………………………

E. HASIL PRAKTIKUM…………………………………………………………………

F. PEMBAHASAN……………………………………………………………………….

G. KESIMPULAN…………………………………………………………………………

H. DAFTAR PUSTAKA………………………………………………………………….
 PENDAHULUAN

A. TUJUAN PRAKTIKUM

1. Dapat mengetahui prinsip kerja alat HPLC

2. Dapat mengoperasikan alat HPLC dengan baik dan benar

3. Dapat menentukan [Paracetamol] dengan metode HPLC

B. DASAR TEORI
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dikenal juga dengan istilah High
Performance Liquid Chromatography (HPLC). KCKT merupakan perangkat peralatan
yang penting dalam perkembangan dunia analisis bahan baku maupun bahan pencemar.
Fungsi utama KCKT pada dasarnya adalah kemampuannya dalam memisahkan berbagai
komponen penyusun dalam suatu sampel. Kinerja tinggi dari kromatografi awalnya
ditentukan oleh ketinggian tekanannya, namun perkembangan teknologi telah
menghasilkan produk kromatografi cair berkinerja tinggi dengan tekanan yang tidak
terlalu tinggi.
KCKT merupakan teknik pemisahan yang masih menjadi idola didunia analisis
saat ini. KCKT digunakan secara luas dalam pemisahan dan pemurnian berbagai sampel
dalam berbagai bidang seperti farmasi, lingkungan, industri makanan dan minuman,
industri polimer dan berbagai bahan baku. KCKT lebih banyak digunakan untuk
keperluan identifikasi (analisis kualitatif), kecuali jika KCKT ini dihubungkan dengan
sebuah spektrometri massa (Mass Spectrometer) atau MS, maka penggunaannya akan
lebih memungkinkan dalam analisis kuantitatif.
Secara umum KCKT digunakan dalam kondisi-kondisi berikut:
1.Pemisahan berbagai senyawa organik maupun anorganik, ataupun spesimen biologis
2.Analisis ketidakmurnian (impurities)
3.Analisis senyawa-senyawa yang tak mudah menguap (non-volatil)
4.Penentuan molekul-molekul netral, ionik maupun zwitter ion
5.Isolasi dan pemurnian senyawa
6.Pemisahan senyawa-senyawa dengan struktur kimia yang mirip
7.Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah kecil (trace elements)
Komponen KCKT
Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan High
Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode yang tidak destruktif
dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif.
KCKT paling sering digunakan untuk :
1. Menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-
asam nukleat, dan protein-protein dalam cairan fisiologis;
2. Menetukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping proses
sintesis, atau produk-produk degradasi dalam sediaan farmasi.
Komatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan teknik pemisahan senyawa dengan
cara melewatkan senyawa melalui fase diam (stationary phase) dengan menggunakan
fase gerak (mobile phase) mengaliri semua ini. Senyawa dalam kolom akan keluar dari
kolom atas dasar kepolaran yang berbeda, sehingga akan mempengaruhi kekuatan
interaksi senyawa dengan fase diam dan fase gerak
Dari kromatogram dapat diidentifikasi waktu retensi (tR) dan luas area/tinggi puncak.
Kedua hal ini berguna untuk :
1. Analisis kualitatif digunakan informasi tR,
2. Analisis kuantitatif digunakan informasi luas
3. Area/tinggi puncak kromatogram
Pada HPLC terdapat kolom terbuka yaitu :
1. Low pressure (tekanan rendah)
2. High pressure (tekanan tinggi 76 bar biasanya memakai satuan kpa/kilo paskal).
Pada HPLC terdapat oven untuk pemanas karena pada partikel kecil, cairan
ditekan terjadi gesekan maka digunakan pendingin dan tekanan tinggi (cairan ditekan
menggunakan pompa kemudian didorong, jika ditarik cairan masuk). Tekanan harus 76
bar, antara fase diam dan fase gerak terjadi gesekan sehingga temperatur meningkat maka
harus diturunkan (dengan pendingin liebig/ ion exchange) karena ikatannya bisa lepas
dan bisa juga terjadi bleeding.
Temperatur pada HPLC digunakan untuk menjaga temperatur dalam kolom konstan
sehingga KD tetap.
a. PRINSIP DASAR
Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan
kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai
fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah
pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit akan
terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu
retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya
terpisah.
Urutan skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa
terhalogenasi < golongan eter < golongan ester < golongan keton < golongan alkohol <
golongan asam.

b. MANFAAT KCKT
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi sering kali digunakan untuk beberapa kepentingan,
seperti :
1. Pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis
2. Analisis ketidakmurnian (impurities)
3. Analisis senyawa tidak mudah menguap (non volatile)
4. Penentuan molekul-moleku netral, ionik, maupun zwitter ion
5. Isolasi dan pemurnian senyawa
6. Pemisahan senyawa-senyawa yg strukturnya hampir sama
7. Pemisahan senyawa-senyawa dlm jml sekelumit (trace elements)
8. Menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu

c. KELEBIHAN DAN KEKURANGAN KCKT

Banyak analisa yang mengutamakan penggunaan KCKT dalam proses kerja mereka,
hal ini dikarenakan KCKT mempunyai beberapa kelebihan dibanding metode
Kromatografi lainnya, diantaranya :
1. Cepat : Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat
diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit
(uncomplicated), waktu analisi kurang dari 5 menit bisa dicapai
 2. Selektif : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana
interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi
dengan zat padat; pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa diam.
Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan rasa diam dan rasa
gerak pada KCKT memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan
yang diinginkan.
3. Peka : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat
mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam- macam
zat. Detektor-detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah
sampai picogram (10-12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer
Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll dapat juga digunakan dalam KCKT.
4. Kolom dapat dipakai lagi : Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom
KCKT dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang bisa dilakukan
dengan kolom yang sama sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan
dari solven dan jenis solven yang digunakan.
5. Ideal untuk molekul besar dan ion : zat – zat yang tidak bisa dianalisis dengan KG
karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk menganalisis psesies
ionik. KCKT dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis
zat – zat tersebut.
6. Mudah memperoleh kembali sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam
KCKT tidak menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang
diperiksa, oleh karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah
sikumpulkan setelah melewati detector. Solvennya dapat dihilangkan dengan
menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukar ion memerlukan prosedur
khusus.
Namun, terdapat pula beberapa kekurangan KCKT yang membuatnya tidak efisien untuk
digunakan, yaitu :
1. Sulit untuk mengidentifikasi senyawa, kecuali jika HPLC dihubungkan
dengan spektrometer massa
2. Jika sampel yang digunakan sangat kompleks, maka resolusi (pemisahan)
yang baik sulit diperoleh
 3. Mahal
4. Sampel yang digunakan jumlahnya sedikit
5. Perlu tenaga ahli untuk mengoperasikan

C. ALAT DAN BAHAN

Alat:
1. Instrumen HPLC 1 set
2. Spatula 1 buah
3. Labu ukur 50 mL 6 buah
4. Labu ukur 10 mL 6 buah
5. Neraca analitik terkalibrasi 1 set
6. Corong pendek 1 buah
7. Pipet tetes 6 buah
8. Gelas kimia 20 mL 1 buah
9. Gelas ukur 500 mL 1 buah
10. Ultrasonic vibrator 1 set
11. Pipe seukuran (1,2,3,4,5 mL) 1 buah
12. Kertas saring Whattmann 1 lembar
13. Membrane PTFE dan selulosa nitrat 1 lembar
Bahan :
1. Natrium benzoat p.a 2,5 mg
2. Vitamin C standar 1 mg
3. Kafein 5 mg
4. Metanol for HPLC secukupnya
5. Sampel minuman yang mengandung vit.C 5 mL
6. Kalium dihidrogenfosfat 0,68 g
7. Aquabides secukupnya
8. Asetonitril 80 mL + secukupnya
D. CARA KERJA
1. Pembuatan fase gerak (pelarut)
Dihitung dan ditimbang jumlah KH2PO4 yang diperlukan untuk membuat larutan
KH2PO4 0,01 M sebanyak 500 mL dalam aquades.

Kemudian di ‘ajust’ pH pada nilai 2,65 dengan asam fosfat.

Dilakukan penyaringan untuk larutan KH2PO4 menggunakan membrane selulosa nitrat.

Dilakukan penyaringan pula untuk asetonitril dengan PTFE. Dihilangkan gelembung
pada larutan dengan ultrasonic vibrator selama 15 menit.

Dibuat campuran larutan fasa gerak KH2PO4 dan asetonitril (60:40) untuk keperluan
larutan standar dan larutan sampel, sesuai kebutuhan.

2. Pembuatan larutan induk natrium benzoat, vitamin C, dan kafein

Ditimbang zat standar natrium benzoat 2,5 mg, vitamin c 1 mg, dan kafein 5 mg.

Dicampurkan ketiga zat standar dengan melarutkan dalam 50 mL fasa gerak secara
kuantitatif pada labu ukur.

Dihomogenkan selama 5 menit menggunakan ultrasonic vibrator.

E. HASIL PRAKTIKUM
F. PEMBAHASAN
HPLC adalah sebuah instrumen yang menggunakan prinsip kromatografi
(pemisahan) dengan menggunakan fase gerak cair yang dialirkan melalui kolom yang
merupakan fase diam menuju ke detektor dengan bantuan pompa. Sampel dimasukkan ke
dalam aliran fase gerak dengan cara penyuntikan.
Di dalam kolom terjadi pemisahan senyawa-senyawa dalam kolom akan keluar atas dasar
kepolaran yang berbeda, sehingga akan mempengaruhi kekuatan interaksi antara senyawa
terhadap fase diam. Senyawa-senyawa yang kurang kuat interaksinya dengan fase diam
akan keluar terlebih dahulu, dan sebaliknya senyawa yang berinteraksi kuat dengan fase
diam akan keluar lebih lama. Senyawa yang keluar dari kolom akan dideteksi oleh
detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram.
Dari kromatogram tersebut akan dapat diidentifikasikan waktu retensi (tR) dan
luas area/tinggi puncak. Informasi tR digunakan untuk analisis kualitatif, sedangkan
informasi luas area atau tinggi puncak untuk analisis kuantitatif.
Waktu Retensi adalah waktu interaksi zat yang akan dianalisis dan fasa diam dalam
kolom sampai selesai dan dideteksi oleh detector. Pengukuran endtime di PC dilebihkan
dari waktu retensi agar peak yang terbentuk dihasilkan sepenuhnya . Jika endtime
disamakan dengan waktu retensi , peak yang terbentuk tidak sepenuhnya. Pada
pengukuran HPLC perlu dilakukan Furging (Purge) untuk menghilangkan gelembung
agar tidak ada gelembung pada kolom yang akan mengganggu proses pemisahan di
kolom. Furging dilakukan ketika akan memindahkan filter dan suatu wadah ke wadah
yang lain,atau ketika setelah mengisi wadah. Ketika proses furging , pump dalam
keadaan terbuka namun tanpa tekanan. Agar gelembung yang ada akan langsung terbawa
ke penampung. Jika pump tertutup gelembung yang ada akan mengalir ke kolom yang
nantinya akan mengganggu. Larutan sampel dan standar harus disaring terlebih dahulu
agar tidak ada padatan atau mineral yang sangat kecil yang dikhawatirkan dapat
menyumbat pipa kapiler.
Dalam HPLC, kolom merupakan jantungnya HPLC yang diisi oleh senyawa non
polar dalam hal ini adalah senyawa organic ,supaya senyawa polar dalam campuran akan
melekat lebih lama pada silica polar. Pemisahan komponen dengan HPLC ini dapat
digunakan untuk proses secara kualitatif maupun kuntitatif. Pengukuran yang didasarkan
secara kualitatif yaitu dengan ditunjukkan oleh waktu retensi. Cara untuk mematikkan
HPLC dapat dilakukan dengan diturunkan terlebih dahulu pompa tetapi mematikkannya
jika detektor telah nol. Kolom harus tetap dalam keadaan dicuci dengan eluen, laju aliran
diturunkan, setelah pompa menunjukkan angka nol maka pompa dimatikan, detektor
dimatikan, setelah itu pastikan hubungan komputer dengan LC telah terputus, setelah itu
matikan komputer dan terakhir adalah putuskan aliran listriknya.
percobaan kali ini menggunakan metode HPLC fase terbalik, karena fase gerak
yang digunakan bersifat polar sedangkan fase diamnya bersifat non polar, dengan sistem
elusi isokratik, artinya selama analisis digunakan fase gerak dengan perbandingan pelarut
yang tetap. Dalam preparasi sampel, sampel ditimbang kemudian dilarutkan
menggunakan aquabidest. Digunakan aquabidest karena dalam analisis menggunakan
HPLC diperlukan pelarut dengan kemurnian yang tinggi, sebab larutan sampel yang akan
dianalisis jumlahnya sangat sedikit (sekitar 20µl) sehingga apabila digunakan pelarut
dengan kemurnian kurang akan dapat mengganggu hasil pemisahan. Sebelum
pengenceran sampel sampai 10 ml, dilakukan sonikasi terlebih dahulu agar semua
komponen dalam sampel larut dan homogen. Setelah diencerkan sampai 10 ml secara
kuantitatif, larutan sampel disaring sebanyak dua kali. Penyaringan pertama dilakukan
menggunakan kertas saring kasar.
Hal tersebut dilakukan karena dalam obat tidak hanya mengandung paracetamol,
namun terdapat zat penyusun lain yang belum larut seluruhnya yang masih berupa
partikel-partikel padat dalam larutan. Selanjutnya filtrate disaring kembali menggunakan
membran selulosa nitrat agar diperoleh larutan sampel murni tanpa ada partikel-partikel
pengganggu /pengotor yang dapat mempengaruhi hasil pemisahan. Apabila langsung
dilakukan penyaringan menggunakan membran selulosa nitrat, dikhawatirkan partikel-
partikel yang tidak larut dalam larutan sampel akan menyumbat pori-pori membran
sehingga penyaringan akan membutuhkan waktu yang lama. Sebelum ditampung,
sebagian filtrat dibuang terlebih dahulu yang dimaksudkan untuk membilas membran
agar dapat dipastikan tidak ada zat kontaminan dari membran yang dapat ikut
tertampung. Analisis pada percobaan kali ini adalah analisis kualitatif dan kuantitatif.
Analisis kualitatif dilakukan dengan membandingkan waktu retensi komponen dalam
sampel dengan waktu reteensi standar. Puncak yang akan muncul pada kromatogram
adalah puncak komponen paracetamol terlebih dahulu. Hal tersebut dapat ditentukan
berdasarkan struktur kimia dari masing-masing komponen.
Pada percobaan kali ini, yang akan dilakukan adalah penentuan kadar parasetamol
dalam sampel dengan metode HPLC. Parasetamol adalah senyawa yang memiliki sifat
polar dan gugus kromofor yang menyebabkan senyawa ini dapat menyerap sinar UV.
Karakteristik senyawa ini memungkinkan analisis dengan teknik HPLC menggunakan
kolom nonpolar seperti C-18 dan fasa gerak polar seperti air atau metanol. (Wiji
dkk,2009:11)
Parasetamol atau asetaminofen adalah obat analgesik dan antipiretik yang populer dan
digunakan untuk melegakan sakit kepala, sengal-sengal dan sakit ringan, dan demam.
Digunakan dalam sebagian besar resep obat analgesik salesma dan flu. Paracetamol aman
dalam dosis standar, tetapi karena mudah didapati, overdosis obat baik sengaja atau tidak
sengaja sering terjadi.
Berbeda dengan obat analgesik yang lain seperti aspirin dan ibuprofen, parasetamol tidak
memiliki sifat antiradang. Jadi parasetamol tidak tergolong dalam obat jenis NSAID.
Dalam dosis normal, parasetamol tidak menyakiti permukaan dalam perut atau
mengganggu gumpalan darah, ginjal atau duktus arteriosus pada janin.
Paracetamol atau Asetaminofen atau N-Acetyl-para-aminophenol memiliki berat molekul
151,17 g/mol, rumus empiris C8H9NO2, titik leleh 169°C-170,5°C, larut dalam etanol,
metanol dan etil asetat, larut dalam air dingin, bersifat polar karena adanya cincin benzen,
nitrogen, amida, dan gugus OH.
paracetamol memiliki gugus hidroksi (-OH) yang dapat membentuk ikatan
hidrogen dengan air sehingga lebih mudah larut dalam air atau senyawa polar lainnya.
Kadar analit dapat ditentukan dengan menghitung konsentrasi analit menggunakan
persamaan garis y = mx + b yang diperoleh dari kurva kalibrasi deret standar. Namun,
apabila luas area puncak analit tidak masuk dalam area deret standar maka digunakan
perbandingan konsentrasi dan luas area deret standar dengan sampel. Sebelum dilakukan
pemisahan, instrument HPLC harus dikondisikan pada keadaan optimal agar hasil
pemisahan yang didapatkan baik. sebelum diinjeksikan ke dalam HPLC perlu dilakukan
degassing untuk menghilangkan gelembung udara karena gelembung udara dapat
 terkumpul di kepala pompa ataupun detektor sehingga akan mengganggu kondisi HPLC.
Pada pengukuran dengan alat HPLC, didapat konsentrasi sampel = 29326,66 ppm

Kesalahan-kesalahan yang mungkin terjadi selama analisis pada percobaan ini di

antaranya, masih terdapat sisa sampel yang telah ditimbang yang tidak ikut dilarutkan
sehingga kadar yang diperoleh kurang akurat, masih terdapat gelembung setelah
dilakukan penginjeksian, atau pengoperasian instrument yang kurang tepat sehingga
mempengaruhi hasil kromatogram yang akan didapat.

G. KESIMPULAN
Dari hasil Praktikum Penentuan [Paracetamol] dengan metode HPLC, didapat:
 Penentuan konsentrasi dilakukan pada lamda 243 nm, dengan laju alir 1,5
mL/menit
 Pada pengukuran dengan alat HPLC, didapat konsentrasi sampel = 29326,66 ppm
 Hubungn konsentrasi dengan luas area yaitu berbanding lurus. Semakin tinggi
konsentrasi paracetamol maka semakin tinggi luas areanya.
H. DAFTAR PUSTAKA
Anonim. 2009. Farmakope Herbal Indonesia edisi I . Departemen Kesehatan Republik
Indoneisa. Jakarta.

Christian G.D., 2003, Analytical Chemistry, Sixth, John Wiley & Sons Inc,New York

https://www.osaaa999.com/2017/10/laporan-penentuan-kadar-paracetamol-hplc.html
Hendayana, S. (1994). Kimia Analitik Instrumen. Bandung: IKIP Semarang Press

Hendayana, S. (2006). Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan Elektroforesis

Modern. Bandung: PT. Remaja Rosdakarya

Mulja.Muhammad, Suharman,1995, Analisis Instrumental, Airlangga University Press,

Surabaya

Sastrohamidjojo,Harjono, 2005, Kromatografi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta

Skoog,DA,Holler,FJ,and West DM,1994, Analytical Chemistry, Six Edition,Hardcourt

Grace College,Florida

Underwood,A.L, 1996, Analisis Kimia Kuantitatif, 554, Penerbit Erlangga, Jakarta

Watson, D.G.,1999,Pharmaceutical Analysis, Churchill Livingstone,Edinburg