MAKALAH

KIMIA BAHAN ALAM II

HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) DAN HPLC
PREPARATIF

OLEH:
KELOMPOK 8
Elvi Nurjanah 2001014
Friska Febriana 2001017
Jeanifer Rimanov Putri 2001022
Nikita Nurul Rifka 2001034
Putri 2001037
Tadzkiah Ghina Adisty 2001043

Dosen Pengampu : apt. Fina Aryani, M.Sc

PROGRAM STUDI S1 FARMASI

SEKOLAH TINGGI ILMU FARMASI RIAU
PEKANBARU
2022

1
 KATA PENGANTAR

Puji dan syukur kami ucapkan atas kehadirat Allah SWT karena berkat rahmat-Nya kami
dapat menyelesaikan makalah dengan judul “High Performance Liquid Chromatography (Hplc)
Dan Hplc Preparatif” ini dengan baik. Makalah ini disusun sebagai salah satu tugas mata kuliah
Kimia Bahan Alam II sebagai salah satu penilaian terhadap mata kuliah ini dan juga untuk
menambah pengetahuan pembaca mengenai High Performance Liquid Chromatography (Hplc)
Dan Hplc Preparatif.
Kami sebagai penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Bapak
Dr. M. Almurdani,M.Si selaku dosen pengampu mata kuliah Kimia Bahan Alam II karena telah
membimbing kami dalam pembuatan makalah dengan judul High Performance Liquid
Chromatography (Hplc) Dan Hplc Preparatif ini.
Dalam penulisan makalah ini, kami menyadari masih banyak kesalahan dan kekurangan.
Oleh karena itu, kami selaku penulis menerima kritik dan saran agar kedepannya bisa lebih baik
lagi. Kami harap makalah ini dapat menambah wawasan dan ilmu pengetahuan bagi pembaca.

Pekanbaru, Desember 2022

Tim Penulis

2
 DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR...................................................................................................................2

BAB I...............................................................................................................................................4

PENDAHULUAN..........................................................................................................................4

1.1   Latar Belakang...................................................................................................................4

1.2 Rumusan Masalah................................................................................................................5

1.3 Tujuan...................................................................................................................................5

BAB II.............................................................................................................................................7

PEMBAHASAN.............................................................................................................................7

2.1   PENGERTIAN...................................................................................................................7

2.2      Jenis- Jenis HPLC...........................................................................................................8

2.3.    Instrument HPLC..........................................................................................................10

2.4    Prinsip Kerja HPLC.......................................................................................................18

2.5    Prinsip Kerja HPLC Preparatif....................................................................................20

2.6    Perbedaan Analitik dan Preparatif HPLC...................................................................21

2.7    Aplikasi Preparatif HPLC dalam bidang Farmasi......................................................21

2.8    Pemecahan Masalah Kromatografi Preparatif............................................................21

BAB III.........................................................................................................................................22

PENUTUP....................................................................................................................................22

3.1 Kesimpulan.........................................................................................................................22

DAFTAR PUSTAKA...................................................................................................................23

3
 BAB I
PENDAHULUAN

   1.1   Latar Belakang
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi (KCKT) adalah salah satu instrument yang dipakai untuk teknik analisis pemisahan
secara kualitatif, kuantitatif, pemisahan/isolasi dan pemurnian. Kromatografi pertama kali
ditemukan oleh Tsweet pada tahun 1903, dimana Tsweet berhasil melakukan pemisahan pigmen
dari daun dengan menggunakan kolom berisi kapur (CaSO4). Tsweet juga menciptakan istilah
kromatografi untuk menggambarkan daerah berwarna yang bergerak menuju bawah kolom.
Adanya proses adsorpsi dinamis dimana molekul analit akan bergerak melewati celah berpori
merupakan prinsip dasar HPLC. Material kolom (fase diam) akan berinteraksi dengan komponen
sampel sehingga terjadi pemisahan. Lamanya waktu interaksi (retention time) dipengaruhi oleh
kekuatan interaksi dari material kolom dan komponen sampel. HPLC menggunakan dua fase
kerja yaitu fase gerak (mobile phase) dan fase diam (stationary phase). Fase gerak berupa cairan
atau pelarut yang berfungsi untuk membawa komponen campuran menuju detektor sedangkan
fase diam adalah fase tetap didalam kolom berupa partikel dengan pori yang kecil dan memiliki
area surface tinggi [1,8]. Gambar 1. Diagram Alir HPLC Fase gerak ditampung dalam resorvoir.
Botol kaca merupakan jenis reservoir yang paling umum digunakan. Dari reservoir, fase gerak
akan dialirkan secara terus menerus dengan kecepatan alir yang tetap oleh pompa. Pengaturan
kecepatan alir fase gerak dilakukan dengan menggunakan program dalam HPLC. Kemudian
sampel diinjeksikan melalui injektor dan akan terbawa oleh fase gerak menuju kolom. Didalam
kolom akan terjadi proses pemisahan dimana komponen sampel akan ditahan oleh fase diam
kemudian akan larut oleh fase gerak yang terus menerus dialirkan sehingga melewati kolom

4
untuk menuju ke detektor. Detektor akan mendeteksi adanya komponen sampel didalam kolom
dan menghitung kadarnya sehingga keluar dalam bentuk angka pada layar komputer.

Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan unsur-unsur yang akan dipisahkan

terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa-fasa ini membentuk suatu lapisan stasioner dengan
luas permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan cairan yang merembes lewat atau
melalui fase yang stasioner. Fasa stasioner mugkin suatu zat padat atau suatu cairan, dan fasa
yang bergerak mungkin suatu cairan atau suatu gas. Maka semua jenis kromatografi yang
dikenal, terbagi menjadi empat golongan: cair-padat, gas-padat, cair-cair, dan gas-cair.

Pembahasan teknik kromatografi modern,  baru lengkap bila disebut kromatografi cairan

kinerja tinggi (HPLC). Kromatografi cairan kolom klasik  merupakan prosedur pemisahan yang
sudah mapan dalam mana fase cair yang mobil mengalir lambat-lambat lewat kolom karena
gravitasi. Umumnya metode itu dicirikan oleh efisiensi kolom yang rendah dan waktu pemisahan
yang lama. Namun sejak kira-kira tahun 1969, perhatian dalam teknik kolom cairan hidup
kembali dengan sangat menyolok karena dikembangkannya sistem tekanan tinggi oleh Kirchland
dan Huber, yang bekerja pada tekanan sampai 2,07 x 107 Nm-2 (3000 p.s.i). Dalam metode ini
digunakan kolom berdiameter kecil (1-3 mm) dan eluen dipompakan ke dalamnya dengan laju
alir yang tinggi (sekitar 1-5 cm3m-1). Pemisahan dengan metode ini dilakukan jauh lebih cepat
(sekitar 100 kali lebih cepat) daripada dengan kromatografi cairan yang biasa. Meskipun
peralatan yang tersedia di pasar dewasa ini agak mahal, HPLC telah terbukti luas penggunaannya
dalam kimia organik

1.2 Rumusan Masalah

1.2.1    Apa defenisi dari High Performance Liquid Chromatography (Hplc) Dan Hplc
Preparatif?

1.2 2   Apa saja jenis- jenis dari High Performance Liquid Chromatography (Hplc) Dan Hplc
Preparatif?

1.2.3    Apa saja Instrument dari High Performance Liquid Chromatography (Hplc) Dan
Hplc Preparatif?

1.2.4    Apa prinsip kerja dari High Performance Liquid Chromatography (Hplc) Dan Hplc
Preparatif?

5
 1.2.5    Bagaimana pengaplikasian dari High Performance Liquid Chromatography (Hplc)
Dan Hplc Preparatif?

1.3 Tujuan
1.3.1   Agar dapat mengetahui dan memahami defenisi dari High Performance Liquid
Chromatography (Hplc) Dan Hplc Preparatif

1.3.2   Agar dapat mengetahui dan memahami jenis- jenis dari High Performance Liquid
Chromatography (Hplc) Dan Hplc Preparatif

1.3.3  Agar dapat mengetahui dan memahami instrument dari High Performance Liquid
Chromatography (Hplc) Dan Hplc Preparatif

1.3.4   Agar dapat mengetahui dan memahami prinsip kerja dari High Performance Liquid
Chromatography (Hplc) Dan Hplc Preparatif

1.3.5 agar dapat mengetahui dan memahami bagaimana cara aplikasi dari High Performance
Liquid Chromatography (Hplc) Dan Hplc Preparatif

6
 BAB II
PEMBAHASAN

   2.1   PENGERTIAN
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Performance Liquid
Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode fisikokimia berdasarkan pada
teknik kromatografi di mana fase geraknya berupa cairan dan fase diam dapat dalam
bentuk cair atau padat. Pada akhir 1960-an, semakin banyak usaha untuk pengembangan
kromatografi cair sebagai suatu teknik untuk mengimbangi kromatografi gas. KCKT
adalah kromatografi cair kolom modern, yang dasarnya merupakan pengembangan dari
kromatografi kolom menjadi suatu sistem pemisahan yang cepat dan efisien.

Peningkatan kecepatan dan efisiensi pemisahannya terkait dengan peningkatan

performa kolomnya yang menggunakan kolom dengan ukuran dimensi dan partikel yang
jauh lebih kecil dari kolom yang dipakai pada kromatografi kolom, sehingga agar fase
gerak dapat mengalir pada kolom, fase gerak dipompa dengan tekanan tinggi. Di samping
itu, kinerja tingginya dalam analisis didukung dengan adanya berbagai sistem deteksi
dengan kepekaan tinggi yang dapat diintegrasikan dengan sistem kromatografinya.

KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi gas (KG), keduanya

dapat digunakan untuk menghasilkan efek pemisahan yang sama baiknya. Bila
derivatisasi diperlukan dalam KG, namun pada KCKT zat-zat yang tidak diderivatisasi
dapat dianalisis. Untuk zat-zat yang labil pada pemanasan atau tidak menguap, KCKT
adalah pilihan utama. Namun demikian bukan berarti KCKT menggantikan KG, tetapi
akan memainkan peranan lebih besar dalam analisis.

Kromatografi cair kinerja tinggi merupakan suatu metode pemisahan canggih

dalam analisis farmasi yang dapat digunakan sebagai uji identitas, uji kemurnian dan

7
 penetapan kadar. Titik beratnya adalah untuk analisis senyawa-senyawa yang tidak
mudah menguap dan tidak stabil pada suhu tinggi, yang tidak bisa dianalisis dengan
metode KG. Banyak senyawa yang dapat dianalisis dengan KCKT mulai dari senyawa
ion anorganik sampai senyawa organik makromolekul. Untuk analisis dan pemisahan
obat/bahan obat campuran rasemis optis aktif dikembangkan suatu fase pemisahan kiral
yang mampu menetukan rasemis dan isomer aktif. Walaupun disadari biaya yang
dibutuhkan untuk analisis dengan KCKT sangat mahal, namun metode ini tetap dipilih
untuk digunakan menganalisis 277 obat / bahan obat karena hasil analisis yang memiliki
akurasi dan presisi yang tinggi dalam waktu analisis yang cepat.

Secara umum KCKT digunakan dalam kondisi-kondisi berikut:

1. Pemisahan berbagai senyawa organik maupun anorganik, ataupun spesimen

biologis
2. Analisis ketidakmurnian (impurities)
3. Analisis senyawa-senyawa yang tak mudah menguap (non-volatil)
4. Penentuan molekul-molekul netral, ionik maupun zwitter ion
5. Isolasi dan pemurnian senyawa
6. Pemisahan senyawa-senyawa dengan struktur kimia yang mirip
7. Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah kecil (trace elements)

   2.2      Jenis- Jenis HPLC

Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya
lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang
non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini,
sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik.
Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase
diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC
sebagai berikut:

1. Kromatografi Adsorbsi

Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam

kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi

8
adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam
silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai
silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang
akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas
yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat
menyebabkan puncak yang berekor.

 2. Kromatografi fase terikat (Kromatografi Partisi)

Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi

secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk
memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan
oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer
digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya
adalah fase terbalik.

fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau
dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah  atau basa lemah,
peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut
akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini
menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika
solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang
mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.

3. Kromatografi penukar ion

HPLC penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation
atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di
pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren
resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan
media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut
campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar
ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau
kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak

9
menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion
sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.

4. Kromatografi Pasangan ion

Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan

sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode
penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang
berlawanan.

5. Kromatografi Eksklusi Ukuran

Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat
digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul >
2000 dalton. Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang
bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau
berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih
besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran
medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan
solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara
partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran
ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe
kromatografi yang lain.

6. Kromatografi Afinitas

Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi

yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya
dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan
sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara
antigen dan antibodi). Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi
protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks.

10
2.3.    Instrument HPLC
Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak (Reservoir) ,
pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah
penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam.
Diagram skematik sistem kromatografi cair dapat dilihat pada gambar di bawah ini :

1 . Wadah fase gerak (Reservoir)

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong
ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini
biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak sebelum
digunakan harus dilakukan deggasing (penghilangan gas) yang ada pada fase gerak.
Sebab adanya gas dalam fase gerak akan mengganggu detektor sehingga akan
mengacaukan hasil analisis. Fase gerak biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat
bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi
dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan
sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada
fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut.
Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan
elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.

Fase Gerak

11
 Fase gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau
pelarut. Selain berfungsi sebagai pembawa komponen-komponen campuran
campuran menuju detector, fase gerak dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh
karena itu, fase gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu
keberhasilan proses pemisahan.

Persyaratan fase gerak HPLC:

1. Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang
akan dianalisis.
2. Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang
dapat mengganggu interpretasi kromatografi.
3. Zat air harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada
kolom.
4. Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak
beracun.
5. Zat air tidak kental. Umumnya kekentalan tidak melebihi 0,5 cP (centi
Poise).
6. Sesuai dengan detector.

Jenis HPLC berdasarkan kepolaran fase diam dan fase gerak:

1. HPLC fase normal

HPLC dengan kombinasi antara fase diam polar dan fase gerak non-polar.

Fase diam yang digunakan seperti silica, alumina, atau trietilenaglikol
yang dilapiskan pada partikel silica. Sedangkan fase gerak yang digunakan
adalah heksana atau i-propileter.

2. HPLC fase terbalik

HPLC dengan kombinasi antara fase diam non-polar dan fase gerak polar.

Fase gerak yang digunakan seperti air, methanol, atau asetinitril.

12
 3. Fase gerak yang baik memberikan factor kapasitas k’  pada rentang yang
sesuai. Untuk cuplikan dengan 2-3 komponen, sebaiknya menggunakan
fase gerak yang memberikan k’ antara 2-5

2. Pompa

Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai

syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak.
Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu
nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi
dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan
preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan
kecepatan 20 mL/menit.

Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk
menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel,
konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan
tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan
aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa
dengan tekanan konstan.

Tiga jenis pompa yang digunakan dalam HPLC

a)      Pompa reciprocating

Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa
dengan cara gerakan piston mundur-maju yang dijalankan oleh motor.
Piston berupa gelas dan berkontak langsung dengan pelarut. Ketika piston
mundur maka bola gelas bawah terangkat dan pelarut masuk, sebaliknya
ketika piston maju maka bola bawah menutup saluran pelarut dan pelarut
yang telah berada di ruang pompa didorong masuk ke dalam kolom. 

b)      Pompa displacement

Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung

yang dilengkapi pendorong yang digerakkan oleh motor. Pompa ini juga

13
 menghasilkan aliran yang cenderung tidak bergantung pada tekanan balik
kolom dan viskositas pelarut.

c)      Pompa pneumatic

Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi.

Pompa jenis ini murah dan bebas pulsa. Akan tetapi mempunya
keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan (<2000 psi) serta
kecepatan alir bergantung pada viskositas pelarut dan takanan balik
kolom.

3. Tempat Injeksi

Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan

disturbansi yang minimum dari material kolom. Sampel yang akan dipisahkan
dimasukkan ke dalam kolom secara otomatis atau manual melalui injeksi. Volume
injeksi sangat tepat karena mempunyai sampel loop dengan variabel volume
(misalnya 20 – 500 μL).

Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :

a) Stop-Flow
Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup,
dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam
cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi
b) Septum

14
 Septum yang digunakan pada HPLC sama dengan yang digunakan pada
Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60-70
atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut
Kromatografi Cair. Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum
injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.
c) Loop Valve
Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih
besar dari 10 μ dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan
adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual).
Pada posisi LOAD, sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE
difungsikan, maka sampel akan masuk ke dalam kolom.

Syarat- syarat injektor yang baik :

1. Dapat memasukkan sampel ke dalam kolom dalam bentuk sesempit
mungkin
2. Mudah digunakan
3. Keberulangan tinggi
4. Dapat bekerja walaupun ada tekanan balik

4. Kolom

Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.
Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya
proses pemisahan solut/analit.

Ada 2 jenis kolom pada KCKT yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.
Perbandingan kedua kolom dapat dilihat di bawah ini :

Parameter Kolom konvensional Kolom mikrobor

Tabung Stainless steel Stainless steel

kolom
Panjang 3,10,15,20 dan 25 Panjang 25 dan 50 cm
cm
Diameter luar 0,25 inci

15
 Diameter luar 0,25 inci
Diameter dalam 4,6 cm
Fase diam Porous, silika ukuran kecil,
silika yang dimodofikasi
secara kimiawi (bonded
phase), atau polimer-
polimer stiren/divinil
benzen.Rata-rata diameter
partikel 3,5 atau 10µm
dengan kisaran sempit.
Tekanan 500-3000 psi
operasional
(35-215 bar
Fase gerak Hidrokarbon+pelarut
terklorinasi atau alkohol
untuk fase normal. Untuk
fase terbalik (reversed
phase) digunakan metanol
atau asetonitril + air atau
bufer.Kecepatan alir : 1-3
ml/menit
Kinerja Efisiensi meningkat dengan
bekurannya ukuran partikel
fase diam, akan tetapi umur
kolom dengan ukuran
partikel 3 µm lebih pendek.
16
Diameter dalam 1 atau 2 mm
Porous, silika ukuran kecil, silika yang
dimodofikasi secara kimiawi (bonded phase),
atau polimer-polimer stiren/divinil
benzen.Rata-rata diameter partikel 3,5 atau
10µm dengan kisaran sempit.
1000-5000 psi
(70-350 bar)
Hidrokarbon+pelarut terklorinasi atau alkohol
untuk fase normal. Untuk fase terbalik
(reversed phase) digunakan metanol atau
asetonitril + air atau bufer.Kecepatan alir 10-
100 µl/menit.Modifikasi instrumen
Sistem penghantaran pelarut yang mampu
memberikan kontrol aliran di bawah
10µl/menit.Katup injeksi sampekl bervolume
kecil;sel detektor bervolume kecil.
Sangat efisiensi dan sensitif, akan tetapi
lambat,konsumsi fase gerak hanya ¼ dari
kolom konvensional.
 Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom
konvensional, yakni:

  Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan
kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10
-100 μl/menit).

  Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika
digabung dengan spektrometer massa.

  Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis
kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.

Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom
konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.

Fase Diam

Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi

secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan
divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya
residu gugus silanol (Si-OH). Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan
menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi
dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang
lain.

Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling
banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan
kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih
pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan
sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi.
Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi
disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan.

5. Detektor

17
 Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal
(yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif)
seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang
spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-
Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:

a. mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel;

b. mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada
kadar yang sangat kecil;
c. stabil dalam pengopersiannya;
d. mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran
pita;
e. signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada
kisaran yang luas  (kisaran dinamis linier);
f. tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

   2.4    Prinsip Kerja HPLC

Adapun prinsip kerja dari KCKT adalah suatu tekhnik yang mana solut atau zat
terlarut terpisah perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati suatu
kolom kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi solut dalam fase
gerak dan fase diam

Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan

kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai
fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah
pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit
akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke detektor
(waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-
puncaknya terpisah. Urutan skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan
hidrokarbon < senyawa terhalogenasi < golongan eter < golongan ester < golongan
keton < golongan alkohol < golongan asam.

18
 HPLC dapat menganalisa secara kualitatif dan kuantitatif. Pada proses kualitatif
cara yang paling umum untuk mengidentifikasi adalah dengan melihat Retention time
(RT). Peak yang mempunyai RT yang sama dengan standard umumnya adalah sebagai
peak milik analat. Selain melihat RT hal lain yang perlu dilihat adalah spektrum 3D dari
signal kromatogram. Zat yang sama akan mempunyai spektrum 3D yang juga sama.
Sehingga jika spektrum 3D antara dua zat berbeda, maka kedua zat tersebut juga
dipastikan adalah zat yang berlainan, meskipun memiliki RT yang sama.

Kemudian melalui analisa kuantitatif dapat diketahui kadar komponen yang

dianalisis di dalam sampel.  Yang berperan dalam proses separasi pada system HPLC
adalah kolom. Ada kolom yang digunakan untuk beberapa jenis analisa, misalnya
kolom C18 yang dapat digunakan untuk analisa carotenoid, protein, lovastatin, dan
sebagainya. Namun ada juga kolom yang khusus dibuat untuk tujuan analisa tertentu,
seperti kolom Zorbax carbohydrat (Agilent) yang khusus digunakan untuk analisa
karbohidrat (mono-, di-, polysakarida). Keberhasilan proses separasi sangat dipengaruhi
oleh pemilihan jenis kolom dan juga fasa mobil.

Setelah komponen dalam sample berhasil dipisahkan, tahap selanjutnya adalah

proses identifikasi. Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram.
Dalam kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis
komponen dalam sample.

Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai

kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk
(overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi.
Oleh karena itu biasanya untuk sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample
yang lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari
impuritis. Sample farmasi biasanya jauh lebih mudah karena sedikit mengandung
komponen selain zat aktif. Sample ini umumnya hanya melalui proses pelarutan saja.

19
2.5 Prinsip Kerja HPLC Preparatif

Instrumen KCKT preparatif yang biasa digunakan yaitu Agilent SD1 yang
dilengkapi dengan fraction collector untuk menghimpun seluruh sampel berdasarkan
waktu, volume atau puncak spektrum pada segala jenis tabung atau bejana yang sesuai.
Instrumen KCKT preparatif yang biasa digunakan yaitu Agilent SD1 yang dilengkapi
dengan fraction collector untuk menghimpun seluruh sampel berdasarkan waktu,
volume atau puncak spektrum pada segala jenis tabung atau bejana yang sesuai. Panjang
gelombang yang digunakan 254 dan 365 nm dengan detektor UV. Kolom yang
digunakan biasanya adalah Agilent Pursuit 5 C18 (250 mm × 21,2 mm, 5 µL] sebagai
fase diam. Sampel yang telah dilarutkan diinjeksikan sebanyak 1 mL ke dalam loop
KCKT Preparatif. Senyawa target akan di dorong oleh fase gerak ke dalam kolom pada
laju alir tertentu dan selanjutnya akan dideteksi oleh detektor. Selanjutnya puncak atau
fraksi-fraksi yang terbentuk dihimpun dengan menggunakan fraction collector.

20
2.6 Perbedaan Analitik dan Preparatif HPLC

Analitik HPLC

 Sampel berpindah dari detector ke limbah

 Digunakan untuk kuantifikasi dan / atau identifikasi senyawa
 Kolom memiliki diameter internal 1-5mm
 Partikel kolom berukuran 5µm atau lebih kecil
 Pompa hplc menyediakan hingga 10ml/menit
 Kelarutan sampel dalam fase gerak biasanya tidak penting

Preparati HPLC

 Sampel berpindah dari detector ke pengumpulan fraksi

 Digunakan untuk isolasi dan pemurnian senyawa
 Kolom memiliki diameter internal 1-10cm
 Partikel kolom berukuran 7µm atau lebih besar
 Pompa hplc menyediakan >> 10ml/menit
 Kelarutan sampel sangat penting

2.7 Aplikasi Preparatif HPLC dalam bidang Farmasi

HPLC Preparatif diterapkan dalam industri farmasi, untuk mempelajari stabilitas

obat dan untuk analisis kendali mutu. Demikian pula, digunakan untuk pemurnian
produk alami

2.8 Pemecahan masalah kromatografi Preparatif

Kotoran dalam sampel dapat mengendap di kepala kolom yang menyebabkan

perubahan bentuk puncak dan waktu retensi. Pengotor ini menghasilkan peningkatan
tekanan kolom. Oleh karena itu kolom kadang-kadang dibilas dengan pelarut yang lebih
kuat untuk menghilangkan kotoran yang terserap.

21
 BAB III
PENUTUP

 3.1 Kesimpulan
Komponen utama dari HPLC yaitu, pompa, injector, elusi gradient, kolom, detector,
pengolahan data.Prinsip dasar HPLC (High Performance Liquid Chromatografi) adalah
pemisahan senyawa-senyawa berdasarkan kepolaran, dimana terdapat fase mobile (gerak)
dan fase stasioner (diam). HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar
senyawa aktif pada obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk- produk
degradasi dalam sediaan farmasi. Contohnya adalah menganalisis parasetamol dan kafein
dalam suatu campuran.

HPLC sebagai suatu metode pemisahan memiliki beberapa keuntungan yaitu

menghasilkan pemisahan yang sangat cepat, dapat memisahkan zat-zat yang tidak mudah
menguap ataupun tak tahan panas, banyak pilihan fasa geraknya, mudah untuk mendapatkan
kembali cuplikan, karena detector pada KCKT tidak merusak komponen zat yang dianalisis,
dan dapat dirangkai dengan instrumen lain untuk meningkatkan efisiensi pemisahan.
Sedangkan kekurangannya adalah larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu, hanya
bisa digunakan untuk asam organic, harus mengetahui kombinasi yang optimum antara
pelarut, analit, dan gradient elusi, harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup
penelitian yang terbatas

22
 DAFTAR PUSTAKA

Gazdik, Zbynek, dkk. 2008. Determination of Vitamin C (Ascorbic Acid) Using High
Performance Liquid Chromatography Coupled with Electrochemical Detection. Journal
Sensors 2008, 8, 7097-7112; DO; 10.3390/s8117097.

Sitorus, L dkk. 2015. Analisis Beberapa Asam Organik dengan Metode High Performance
Liquid Chromatography (HPLC) Grace Smart Rp 18 5 µ. Jurusan Kimia, FMIPA, Unsrat,
Manado

23