Proposal Penelitian

VALIDASI METODE DAN ANALISIS ASAM RETINOAT

DENGAN METODE SPEKTROFOTOMETRI UV-VIS
PADA KRIM PEMUTIH WAJAH YANG BEREDAR
DI PASAR KOTA KENDARI
Oleh
Nur Fauziah
F1F1 12 076

Dosen Pebimbing:
Dosen Pebimbing:
1. Irnawati, S.Si., M.Sc 1. Prof. Dr. Nurdin, M.Si.
2. Muh. Handoyo Sahumena, S.Pd., M.Sc 2. Fery Indradewi, S.Si., M.Si., Apt.
3. Nur Illiyyin Akib, S.Si., M.Si., Apt
 Latar Belakang
• Kosmetik berasal dari kata Yunani “kosmetikos” yang berarti keahlian dalam menghias
• Sebagian besar wanita Indonesia menginginkan wajah yang putih, bersih dan cerah
untuk menjaga penampilan agar tetap menarik
• Salah satu cara yang dilakukan dengan menggunakan krim pemutih
• Salah satu bahan kimia yang sering ditambahkan dan telah dilarang penggunaannya
dalam kosmetik dan berbahaya jika digunakan dalam jangka panjang adalah asam
retinoat
• Asam retinoat (Retinoid Acid ) atau tretinoin termasuk golongan obat keras yang dapat
menyebabkan kulit kering, rasa terbakar, dan teratogenik sehingga penggunaannya
harus dengan resep dokter (Badan POM, 2007).
• Hasil investigasi dan pengujian laboratorium Badan Pengawas Obat dan Makanan
Republik Indonesia (BPOM) di seluruh Indonesia sampai dengan bulan Maret 2013 telah
ditemukan 17 kosmetik yang mengandung bahan berbahaya/dilarang dan telah beredar,
salah satunya adalah kosmetik yang mengandung asam retinoat (Badan POM, 2013).
• Suhartini (2013) dan Rahayu (2014) menemukan asam retinoat pada krim pemutih
wajah yang beredar bebas di kota Manado dan Purwokerto
• Metode analisis KCKT, KLT (Badan POM, 2011) dan Spektrofotometri UV-Vis (Suhartini,
dkk., 2013).
 Spektrofotometri
• Spektrofotometri UV-Vis adalah salah satu metode yang
paling sering digunakan dalam analisis farmasi, karena
sederhana, mudah, cepat dan merupakan metode analisis
yang ekonomis (Nijhu, dkk., 2011). Selain itu asam retinoat
memiliki kromofor berupa alkena, karboksil dan benzen
sehingga dapat dianalisis menggunakan spektrofotometri

CH3 CH3 CH3 O

H3C

C OH

CH3
• Validasi metode merupakan elemen penting dari
kontrol kualitas. Validasi membantu memberikan
jaminan bahwa pengukuran akan dapat
dipercaya. Menurut Eurochem, validasi adalah
konfirmasi melalui pemeriksaan dan penyediaan
bukti objektif bahwa persyaratan tertentu untuk
penggunaan yang dimaksudkan tertentu
terpenuhi. Parameter validasi metode analisis
meliputi akurasi, presisi, spesifisitas, batas
deteksi (LOD) dan batas kuantifikasi (LOQ)
(Riyanto, 2014).
 Akurasi
• Akurasi adalah kedekatan hasil uji antara hasil yang diperoleh dengan nilai
sebenarnya (true value) atau dengan nilai referensinya (Chan, dkk., 2004). Akurasi
dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan.
• Akurasi dapat ditentukan melalui dua cara, yaitu metode simulasi (standar sebagai
sampel) dan Metode penambahan bahan baku (standar adisi). Dalam metode
simulasi sejumlah analit bahan murni diukur kadarnyaterlebih dahulu (dengan
konsentrasi yang sudah diketahui), kemudian ditambahkan kedalam bahan
campuran pembawa sediaan (placebo adalah campuran pereaksi yang digunakan)
lalu campuran diukur dan dianalisis, dan hasilnya dibandingkan dengan kadar
analit yang ditambahkan (kadar sebenarnya). Pada metode penambahan baku,
sejumlah analit bahan murni yang diketahui kadarnya ditambahkan pada sampel
yang telah mengandung analit, namun tidak diketahui kuantitasnya. Matriks
sampel yang telah mengandung analit juga dianalisis. Selisih kedua hasil
dibandingkan dengan kadar yang sebenarnya (Riyanto, 2014).
 Presisi
• Presisi adalah ukuran yang menunjukan derajat kesesuaian antara hasil
individual, diukur melalui penyebaran hasil individual rata-rata jika
prosedur ditetapkan secara berulang pada sampel yang diambil dari
campuran yang homogen (Chan dkk., 2004).
• Kriteria presisi diberikan jika metode memberikan simpangan baku relatif
atau koefisien variasi < 2%.
• Menurut Sumardi (2005) presisi dinyatakan dengan persentase Relative
Standard Deviasion (% RSD) dengan batas-batas yang masih dapat
diterima berdasarkan ketelitiannya. Tingkat ketelitiannya dapat dilihat
pada Tabel 2.
Nilai RSD Kategori

RSD1% Sangat teliti

1%<RSD2% Teliti

2%<RSD5% Ketelitian sedang

RSD> 5% Ketelitian rendah

 Spesifitas
• Spesifitas suatu metode adalah kemampuan suatu
metode yang hanya mengukur zat tertentu saja
secara cermat dan seksama dengan adanya
komponen lain yang mungkin ada dalam matriks
sampel
• Suatu metode analisis dapat dikatakan spesifik
(selektif) jika metode tersebut hanya
menggambarkan keberadaan dari analit yang dituju
didalam sampel yang didalamnya terdapat senyawa
pengganggu (Harvey, 2000).
 Linearitas

• Linearitas merupakan kemampuan suatu

metode untuk memperoleh hasil-hasil uji yang
secara langsung proporsional dengan
konsentrasi analit pada kisaran yang diberikan.
Linearitas suatu metode merupakan ukuran
seberapa baik kurva kalibrasi yang
menghubungkan antara respon (y) dengan
konsentrasi (x). Linearitas dapat diukur
dengan melakukan pengukuran tunggal pada
konsentrasi yang bervariasi.
 Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantifikasi (LOQ)

• Batas deteksi atau LOD (limit of detection)

didefinisikan sebagai konsentrasi analit
terendah dalam sampel yang masih dapat
dideteksi. Sedangkan batas kuantifikasi atau
LOQ (limit quantification) didefinisikan sebagai
konsentrasi analit terendah dalam sampel
yang dapat ditentukan dengan presisi, dan
akurasi yang dapat diterima pada kondisi
operasional metode yang digunakan (Gandjar
dan Abdul, 2012).
 Rumusan Masalah

• Berdasarkan latar belakang maka terdapat

beberapa masalah yang dapat dirumuskan
sebagai berikut :
• Bagaimana akurasi, presisi, dan spesifisitas dari
metode analisis yang digunakan?
• Berapa batas deteksi, batas kuantifikasi serta
linearitas dari metode analisis yang digunakan?
• Apakah terdapat senyawa asam retinoat pada
sediaan krim pemutih wajah yang beredar di
pasar Kota Kendari?
 Tujuan Penelitian

• Tujuan dilakukannya penelitian ini yaitu :

• Untuk mengetahui akurasi, presisi, dan
spesifisitas dari metode analisis yang digunakan.
• Untuk mengetahui batas deteksi, batas
kuantifikasi serta linearitas dari metode analisis
yang digunakan.
• Untuk mengetahui apakah terdapat senyawa
asam retinoat pada sediaan krim pemutih wajah
yang beredar di pasar Kota Kendari
 Manfaat Penelitian

• Manfaat dilakukannya penelitian ini yaitu :

• Bagi peneliti
• Manfaat dari penelitian ini yaitu dapat menambah pengetahuan
mengenai cara menganalisis kandungan senyawa asam retinoat
pada sediaan krim pemutih wajah yang beredar di Kota Kendari.
• Bagi institusi
• Memberikan kontribusi kepada universitas berupa hasil penelitian,
sehingga bisa menjadi referensi dan informasi bagi peneliti lainnya
khususnya dalam bidang analisis farmasi.
• Masyarakat
• Memberikan informasi pada masyarakat mengenai pada sediaan
krim pemutih yang aman dan tidak mengandung bahan berbahaya
bagi kesehatan
Kerangka Konsep
 METODE PENELITIAN

• Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini akan dilaksanakan pada bulan Mei 2016 sampai Agustus 2016 di
Laboratorium Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Halu Oleo Kendari.
• Jenis Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorium yaitu dilakukan
pengujian secara kualitatif terhadap sampel krim pemutih untuk mengetahui
keberadaan asam retinoat. Sampel yang positif mengandung asam retinoat
kemudian dilanjutkan dengan pengujian secara kuantitatif untuk mengetahui kadar
asam retinoat yang terkandung dalam sampel krim pemutih yang beredar di pasar
kota Kendari.
• Bahan Penelitian
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini yaitu sampel krim pemutih, baku
asam retinoat , metanol (pro analis), dan hidrokuinon.
• Alat Penelitian
Timbangan analitik (Precisa®), spektrofotometer UV-Vis (Jenway®), gelas kimia (Iwaki
Pyrex®), gelas ukur (Iwaki Pyrex®), labu ukur (Duran®), tabung sentrifus, pipet ukur,
pipet tetes, batang pengaduk, spatula, gelas arloji, dan filler.
 Prosedur Penelitian

• Pengambilan Sampel Krim Pemutih

Teknik pengambilan sampel dilakukan dengan metode purposive sampling.
Pengambilan sampel dilakukan pada beberapa pasar yang ada di Kota
Kendari berdasarkan ketidaklengkapan informasi atau keterangan yang
seharusnya tercantumkan dalam etiket wadah dan atau pembungkus,
seperti kode produksi (nomor batch), nomor izin edar, bulan dan tahun
kadaluarsa. Masing-masing pasar diambil satu sampel sebanyak 5 merek
sampel yaitu sampel A, sampel B, sampel C, sampel D dan sampel E.
• Pembuatan Larutan Asam Retinoat 1000 µg/mL
Baku asam retinoat ditimbang 10 mg, dimasukkan kedalam labu ukur 10
mL, lalu ditambahkan metanol sampai garis tanda dan dihomogenkan.
• Pembuatan Larutan Asam Retinoat 500 µg/mL
Larutan asam retinoat 1000 µg/mL diambil 5 mL, dimasukkan kedalam
labu ukur 10 mL, lalu ditambahkan metanol sampai garis tanda dan
dihomogenkan.
• Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Larutan Asam
Retinoat
Larutan asam retinoat 500 µg/mL dipipet 1,5 mL dan dimasukkan
kedalam labu ukur 25 mL (konsentrasi 30 µg/mL), lalu ditambahkan
metanol sampai garis tanda dan dihomogenkan. Diukur serapan
maksimum pada panjang gelombang 200 – 400 nm dengan
menggunakan blanko. Blanko yang digunakan adalah metanol.
• Pembuatan Kurva Kalibrasi
Larutan asam retinoat 500 µg/mL dipipet, dimasukkan kedalam labu
ukur 25 mL berturut- turut 0,5 mL, 1 mL, 1,5 mL, 2 mL dan 2.5 mL
(10 µg/mL, 20 µg/mL, 30 µg/mL, 40 µg/mL dan 50 µg/mL).
Kedalam masing-masing labu ukur tersebut ditambahkan
metanol sampai garis tanda dan dihomogenkan. Diukur
serapannya pada panjang gelombang maksimum dan metanol
sebagai blanko.
 Analisis Kualitatif dan Kuantitatif

• Preparasi sampel
Sampel uji diimbang 3 g, masukkan ke dalam tabung sentrifus, dibungkus dengan
aluminium foil, ditambahkan 50 mL metanol dan dicampur menggunakan vortex
mixer selama 5 menit. Didinginkan dalam es selama 15 menit dan saring
melalui kertas saring Whatman no. 41 (BPOM, 2011).
• Uji kualitatif
Sampel uji yang telah dipreparasi kemudian diamati spektranya pada panjang
gelombang 200 – 400 nm dan dibandingkan dengan spektra yang dihasilkan dari
larutan baku asam retinoat. Sampel yang memiliki kemiripan spektra dengan
larutan baku asam retinoat, selanjutnya dilakukan uji kuantitatif.
• Uji kuantitatif
Sampel yang positif mengandung asam retinoat, diukur absorbansinya pada panjang
gelombang maksimum. Kemudian absorbansi yang diperoleh disubtitusikan
kedalam persamaan kurva baku y = bx + a, dengan y adalah nilai absorbansi dan x
adalah kadar terukur.
• Validasi Metode
• Akurasi
Sampel krim pemutih ditimbang sebanyak 1 g kemudian dimasukkan ke dalam tabung sentrifus.
Metanol sebanyak 10 mL ditambahkan dan dicampur menggunakan vortex mixer selama 5
menit. Pengujian akurasi dilakukan dengan metode penambahan baku (standar adisi), ditambahkan
larutan asam retinoat 10 µg/mL, 30 µg/mL dan 50 µg/mL dalam larutan sampel. Analit uji
dimasukkan dalam kuvet kemudian diukur serapannya pada panjang gelombang maksimum dengan
menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Pengukuran serapan 3 variasi konsentraasi (10 µg/mL, 25
µg/mL dan 50 µg/mL) masing-masing dilakukan pengulangan sebanyak 3 kali (triplo). Nilai yang
didapatkan dihitung nilai % recovery.

Pengujian akurasi dapat dihitung melalui % perolehan kembali (% recovery) dengan rumus sebagai
berikut (Riyanto, 2014):
% Perolehan kembali =
A = kadar analit terhitung
C = kadar analit yang ditambahkan
B* = faktor pengenceran (*jika ada)
• Presisi
Larutan baku asam retinoat konsentrasi 20 µg/mL dipipet sebanyak 10 mL. Kemudian diukur
absorbansinya pada panjang gelombang maksimum dan diulangi pengukurannya sebanyak 10
kali, selanjutnya dapat diketahui nilai standar deviasi dan relativ standar deviasi dari data
yang didapatkan.

Presisi dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut (Miller dan Miller, 2010):

Keterangan :
RSD= relative standard deviasi
SD = standar deviasi
x = kadar hidrokuinon yang terukur
= kadar rata-rata hidrokuinon dalam sampel
n = perlakuan
• Spesifisitas
Ditimbang 1 g sampel krim pemutih yang tidak mengandung asam
retinoat, dimasukkan ke dalam tabung sentrifus, dibungkus
dengan aluminium foil, kemudian ditambahkan 50 mL metanol
dan dicampur menggunakan vortex mixer selama 5 menit.
Didinginkan dalam es selama 15 menit dan disaring melalui
kertas saring Whatman no. 41. Diambil 4 mL dari larutan sampel, 4
mL hidrokuinon 20 µg/mL, 4 mL larutan standar asam retinoat 20
ppm, kemudian masing-masing larutan tersebut dimasukkan ke
dalam kuvet dan diamati spektra yang terbentuk pada panjang
gelombang 200-400 nm. Hal yang sama dilakukan pada campuran
dari semua larutan tersebut (sampel, larutan standar asam retinoat
20 µg/mL, dan hidrokuinon 20 µg/mL).
• Linearitas
Pengujian linearitas berdasarkan nilai koefisien korelasi (r)
pada persamaan regresi linear. Data yang diperoleh
selanjutnya diproses dengan metode kuadrat terkecil,
untuk selanjutnya dapat ditentukan nilai kemiringan
(slope), intersep, dan koefisien korelasinya.
• Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantifikasi (LOQ)
Batas deteksi dan batas kuantitasi dihitung secara statistik
melalui persamaan regresi linear dari kurva kalibrasi.
Perhitungan tersebut dapat dilakukan dengan cara
memasukkan absorbansi larutan baku hasil pengukuran
ke dalam persamaan regresi linier yang diperoleh.
 Pengolahan Data

• Akurasi
Pengujian akurasi dapat dihitung melalui % perolehan kembali (% recovery)
dengan rumus sebagai berikut (Riyanto, 2014):

% Perolehan kembali =
Keterangan :
A = kadar analit terhitung
C = kadar analit yang ditambahkan
B* = faktor pengenceran (*jika ada)
• Presisi
Presisi dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut (Miller dan Miller, 2010):

Keterangan :
RSD = relative standard deviasi
SD = standar deviasi
x = kadar hidrokuinon yang terukur
= kadar rata-rata hidrokuinon dalam sampel
n = perlakuan
• Spesifisitas
Pengujian spesifisitas dapat dihitung melalui absorbansi total pada setiap
panjang gelombang seperti rumus sebagai berikut (Sastrohamidjojo, 2001)
:
• Linearitas
Pengujian linearitas berdasarkan nilai r pada persamaan regresi linear. Data
yang diperoleh selanjutnya diproses dengan metode kuadrat terkecil,
untuk selanjutnya dapat ditentukan nilai kemiringan (slope), intersep,
koefisien korelasinya. Slope, intersep dan koefisien regresi dapat
ditentukan dengan rumus sebagai berikut (Gandjar dan Abdul, 2012):

Keterangan :
y = bx + a
y = menyatakan absorbansi
x = konsentrasi
b = koefisien regresi (juga menyatakan slope =
kemiringan)
a = tetapan regresi dan juga disebut dengan intersep
• Metode perhitungan LOD dan LOQ berdasarkan persamaan garis regresi
dari kurva baku yakni y = bx + a, kemudian diolah dengan rumus (Harmita,
2004)

Keterangan:
SD = Standar Deviasi
LOD = Batas Deteksi
LOQ = Batas Kuantisasi
y = Absorbansi yang terbaca
yi =Absorbansi yang sudah dimasukkan ke persamaan
n = Perlakuan
• TERIMAKASIH