KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI ( HPLC )

Pengertian Kromatografi cair kinerja tinggi ( HPLC ) :

Kromatografi cair kinerja tinggi ( HPLC ) merupakan bentuk kromatografi cair untuk
memisahkan senyawa yang dilarutkan dalam larutan. Instrumen HPLC terdiri dari reservoir
fase gerak, pompa, injektor, kolom pemisahan, dan detektor. Senyawa dipisahkan dengan
menyuntikkan plug campuran sampel ke dalam kolom. Berbagai komponen dalam campuran
melewati kolom pada tingkat yang berbeda karena perbedaan dalam perilaku partisi mereka
antara fase gerak cair dan fase diam. Kromatografi cair kinerja tinggi ( HPLC ) adalah suatu
teknik pemisahan yang dapat digunakan untuk analisis molekul organik dan ion. HPLC
didasarkan pada mekanisme adsorpsi, partisi dan pertukaran ion, tergantung pada jenis fase
diam digunakan. HPLC melibatkan fase diam padat, biasanya dikemas dalam kolom stainless
steel, dan fase gerak cair. Pemisahan komponen larutan dari perbedaan rasio distribusi relatif
dari zat terlarut antara dua fase.
Mekanisme Kromatografi cair kinerja tinggi ( HPLC ) :
Pelarut harus dihilangkan gasnya untuk menghilangkan pembentukan gelembung.
Pompa memberikan tekanan tinggi yang stabil tanpa berdenyut, dan dapat diprogram untuk
beragam komposisi pelarut selama pemisahan. Sampel cairan dimasukkan ke dalam sampel
lingkaran injeksi dengan jarum suntik. Ketika loop diisi, injektor dapat menyuntikkan sampel
ke lingkaran dengan menempatkan sampel lingkaran sesuai dengan fase gerak tabung.
Berbagai jenis kolom HPLC dijelaskan dalam dokumen terpisah. Kehadiran analit dalam
kolom limbah dicatat dengan mendeteksi perubahan indeks bias, serapan UV-VIS pada set
panjang gelombang, fluoresensi setelah eksitasi dengan panjang gelombang yang sesuai, atau
respons elektrokimia. Spektrometer massa juga dapat dihubungkan dengan kromatografi cair
untuk memberikan informasi struktural dan membantu mengidentifikasi analit dipisahkan.

nt

http://www.chemicool.com/definition/high_performance_liquid_chromatography_hplc.html
17.55

Instrumentasi Kromatografi cair kinerja tinggi ( HPLC ) :

Instrumennya terdiri dari sistem pompa, injektor, kolom kromatografi, fase gerak dan fase
diam, detektor dan alat pengumpulan data (komputer, integrator atau perekam).

1. Sistem Pemompaan
Pompa HPLC mengalirkan pelarut dan sampel melalui kolom. Untuk
mengurangi variasi dalam elusi, pompa harus mempertahankan keadaan konstannya
dan laju alir. Ini dicapai dengan pompa multi-piston. Kehadiran dua piston
memungkinkan laju aliran dikendalikan oleh satu piston untuk mengisi kembali yang
lainnya. Sebuah pompa jarum suntik dapat digunakan untuk kontrol yang lebih besar
dari laju alir. Namun, pompa jarum suntik tidak mampu menghasilkan banyak tekanan
sebagai pompa piston, sehingga tidak dapat digunakan dalam semua aplikasi HPLC.
http://chemwiki.ucdavis.edu/Analytical_Chemistry/Instrumental_Analysis/Chromatog
raphy/High_performance_liquid_chromatography
Sistem pemompaan komputer atau mikroprosesor yang dikendalikan mampu
secara akurat memberikan fase gerak baik konstan (elusi isokratik) atau bervariasi
(gradien elusi) komposisi, menurut sebuah program yang ditetapkan. Dalam kasus
elusi gradien, pencampuran pelarut dapat dicapai baik pada rendah atau tekanan tinggi
sisi pompa (s). Tergantung pada sejumlah faktor termasuk dimensi kolom, ukuran
partikel fase diam, laju alir dan komposisi fase gerak, tekanan operasi hingga 42.000
kPa (sekitar 6000 psi) dapat dihasilkan.

2. Injector
Larutan sampel biasanya dimasukkan ke dalam fase gerak mengalir pada atau
dekat kepala kolom menggunakan sistem injeksi didasarkan pada desain katup injeksi
yang dapat beroperasi pada tekanan tinggi. Sistem injeksi tersebut memiliki lingkaran
tetap atau volume perangkat variabel yang dapat dioperasikan secara manual atau
dengan auto-sampler. Mengisi sebagian dari loop dapat menyebabkan volume injeksi
presisi sedikit.
3. Kolom kromatografi
Kolom biasanya terbuat dari stainless steel, panjangnya adalah antara 50 dan
300 mm dan memiliki diameter antara 2 dan 5 mm. Mereka umumnya diisi dengan
fase diam dengan ukuran partikel 3-10 um. Kolom dengan diameter internal kurang
dari 2 mm sering disebut sebagai kolom microbore. Idealnya suhu fase gerak dan
kolom harus dijaga konstan selama analisis. Kebanyakan pemisahan dilakukan pada
suhu kamar tetapi kolom dapat dipanaskan menggunakan misalnya blok pemanas atau
oven kolom untuk mencapai efisiensi yang lebih baik.
4. Fasa diam dan fase gerak
Fasa diam :
Pemisahan obat-obatan biasanya dicapai dengan partisi senyawa dalam larutan
uji antara fase gerak dan fase diam. Sistem HPLC yang terdiri dari fasa diam polar
dan fase gerak non-polar digambarkan sebagai kromatografi fase-normal, sedangkan
HPLC dengan fasa diam non-polar dan fase gerak polar disebut kromatografi fase
terbalik.
Ada banyak jenis fasa diam yang digunakan dalam HPLC termasuk:

Silika yang tak dimodifikasi, alumina atau grafit berpori, yang digunakan
dalam kromatografi fase-normal, di mana pemisahan berdasarkan perbedaan

adsorpsi.
Modifikasi polimer, silika, atau grafit berpori, yang digunakan dalam fase
terbalik HPLC, di mana pemisahan didasarkan terutama pada partisi dari

molekul antara fase gerak dan fase diam.

Resin atau polimer dengan gugus asam atau basa, yang digunakan dalam
kromatografi pertukaran ion, di mana pemisahan berdasarkan persaingan

antara ion untuk dipisahkan dan spesies di fase gerak.

Silika berpori atau polimer.

Fasa gerak :
Pilihan fase gerak didasarkan pada perilaku retensi yang diinginkan dan sifat
fisikokimia analit serta jenis detektor yang dipilih. Untuk fase-normal HPLC
menggunakan fasa diam dimodifikasi pelarut lipofilik. Keberadaan air di fase gerak
harus dihindari karena ini akan mengurangi efisiensi fase diam. Dalam fase terbalik
HPLC fase gerak berair, dengan dan tanpa pengubah organik.
Fase gerak harus disaring melalui filter membran-jenis yang cocok untuk
menghilangkan partikel atau bahan yang tidak larut. Fase gerak multikomponen harus
disiapkan dengan mengukur volume yang diperlukan (kecuali massa yang ditentukan)
dari masing-masing komponen, diikuti oleh pencampuran manual atau mekanis.
Fase gerak mungkin berisi komponen lainnya, misalmnya counter-ion untuk
kromatografi pasangan ion atau pemilih kiral untuk kromatografi kiral menggunakan
fase diam akiral.
5. Detektor
Ultraviolet / sinar tampak (UV / vis) spektrofotometer merupakan serapan
yang

umum

digunakan

detektor

dalam

analisis

farmasi.

Dalam

spesifik

spektrofotometer kasus fluoresensi, refractometers diferensial (RI), detektor

elektrokimia, detektor yang menguapkan - hamburan cahaya (ELSD), detektor aerosol
(CAD), spektrometer massa (MS) atau detektor khusus lainnya dapat digunakan.
Dimana suatu analit memiliki kromofor yang menyerap radiasi UV / vis, UV / vis
detektor adalah pilihan pertama karena sinyal yang menguntungkan. Detektor seperti
itu tidak cocok untuk mendeteksi analit dengan kromofor sangat lemah. Sensitivitas
ditingkatkan dapat dicapai dalam kasus-kasus tertentu dengan menggunakan prakolom atau teknik derivatisasi pasca kolom. ( Teknik ini biasanya tidak digunakan
untuk mengontrol kotoran ).
Perangkat pengumpulan data :
Sinyal dari detektor dapat dikumpulkan pada perekam grafik atau integrator
elektronik yang bervariasi dalam kompleksitas dan dalam kemampuan mereka untuk
memproses, menyimpan dan memproses ulang data kromatografi. Kapasitas
penyimpanan data perangkat ini biasanya terbatas. Stasiun data modern berbasis

komputer dan memiliki kapasitas penyimpanan yang besar untuk mengumpulkan,

memproses dan menyimpan data untuk kemungkinan pengolahan berikutnya.

Penggunaan Kromatografi cair kinerja tinggi ( HPLC ) :

Analisis HPLC dari -sitosterol dalam obat herbal dan minyak sayur
Analisis asam lemak metil ester dan trigliserida dalam biodiesel campuran bahan

bakar
Analisis antibiotik kuinolon dengan ultra-kromatografi cair kinerja tinggi
Analisis astaxanthin dan canthaxanthin
Analisis nukleotida dalam ikan dengan HPLC
Analisis gula alkohol
Analisis vitamin E dalam minyak goreng
Analisis koenzim Q10
Analisis vitamin B1 (thiamine)
Analisis tetrodotoxin
Analisis kalium bromat di makanan
Analisis L-carnitine
Analisis pestisida karbamat
Analisis ion bromate dengan metode ion tribromide

http://www.hitachi-hitec.com/global/science/appli/appli_lc.html

KROMATOGRAFI GAS ( GC )
Pengertian kromatografi gas ( GC ) :

Sebuah kromatografi gas (GC) merupakan instrumen analitis yang mengukur

kandungan berbagai komponen dalam sampel. Analisis yang dilakukan oleh gas kromatograf
disebut kromatografi gas.
Prinsip kromatografi gas ( GC ) :
Larutan sampel disuntikkan ke instrumen memasuki aliran gas yang mengangkut
sampel ke dalam tabung pemisahan yang dikenal sebagai "kolom." ( Helium atau nitrogen
digunakan sebagai apa yang disebut gas pembawa ). Berbagai komponen dipisahkan dalam
kolom. Detektor mengukur kuantitas komponen yang keluar dari kolom. Untuk mengukur
sampel dengan konsentrasi yang tidak diketahui, sampel standar dengan konsentrasi diketahui
disuntikkan ke instrumen. Standar puncak sampel waktu retensi (waktu penampilan) dan
daerah

dibandingkan

dengan

sampel

uji

untuk

menghitung

konsentrasi.

http://shimadzu.com/an/gc/index.html

Instrumentasi kromatografi gas ( GC ) :

gas pembawa
Gas pembawa harus kimia inert. Gas yang digunakan meliputi nitrogen, helium, argon, dan
karbon dioksida. Pilihan gas pembawa seringkali tergantung pada jenis detektor yang
digunakan. Sistem gas pembawa juga berisi saringan molekuler untuk menghilangkan air dan
kotoran lainnya.

Pelabuhan injeksi sampel

Untuk efisiensi kolom yang optimal, sampel tidak boleh terlalu besar, dan harus
diperkenalkan ke dalam kolom sebagai "plug" uap - injeksi lambat sampel besar
menyebabkan pelebaran pita dan kehilangan resolusi. Metode injeksi yang paling umum
adalah di mana microsyringe digunakan untuk menyuntikkan sampel melalui septum karet ke
port vapouriser flash pada kepala kolom. Suhu port sampel biasanya sekitar 50 C lebih
tinggi dari titik didih komponen volatil paling sampel. Untuk kolom dikemas, ukuran sampel
berkisar dari persepuluh mikroliter hingga 20 mikroliter. Kolom kapiler, di sisi lain,

membutuhkan sampel lebih sedikit, biasanya sekitar 10-3 mL. Untuk kapiler GC, split
injection / pisah digunakan. Silahkan lihat pada diagram ini injektor split / pisah;

Injektor dapat digunakan dalam salah satu dari dua mode; split atau pisah. Injector berisi
ruang dipanaskan mengandung liner kaca ke mana sampel disuntikkan melalui septum. Gas
pembawa memasuki ruangan dan dapat meninggalkan tiga rute (ketika injector dalam mode
split). Sampel vapourises untuk membentuk campuran gas pembawa, larutan pelarut dan
vapourised vapourised. Sebagian dari campuran ini melewati ke kolom, tetapi sebagian
keluar melalui outlet split. Outlet septum purge mencegah komponen septum berdarah
memasuki kolom.

kolom

Ada dua jenis umum kolom, dikemas dan kapiler (juga dikenal sebagai tubular terbuka).
Dikemas kolom berisi halus yang terpisah, inert bahan pendukung padat (umumnya

didasarkan pada tanah diatom) dilapisi dengan fase diam cair. Kolom paling dikemas adalah
1,5 - 10 m panjang dan memiliki diameter internal 2 - 4 mm.

Kolom kapiler memiliki diameter internal beberapa persepuluh milimeter. Mereka bisa
menjadi salah satu dari dua jenis; -dinding dilapisi terbuka tubular (WCOT) atau dilapisi
dukungan terbuka tubular (SCOT). Kolom-dinding dilapisi terdiri dari tabung kapiler yang
dindingnya dilapisi dengan fase diam cair. Dalam kolom berlapis dukungan, dinding dalam
kapiler dilapisi dengan lapisan tipis bahan pendukung seperti tanah diatom, ke mana fase
diam telah teradsorpsi. Kolom SCOT umumnya kurang efisien daripada kolom WCOT.
Kedua jenis kolom kapiler lebih efisien daripada kolom dikemas.

Pada tahun 1979, tipe baru kolom WCOT telah dibuat - yang (FSOT) kolom Fused Silica
Terbuka Tubular;

Ini memiliki dinding lebih tipis daripada kolom kapiler kaca, dan diberi kekuatan oleh lapisan
Polimida. Kolom ini fleksibel dan dapat digulung ke dalam gulungan. Mereka memiliki
keuntungan dari kekuatan fisik, fleksibilitas dan reaktivitas rendah.

suhu kolom

Untuk pekerjaan yang tepat, suhu kolom harus dikontrol untuk dalam persepuluh gelar. Suhu
kolom optimum bergantung pada titik didih sampel. Sebagai aturan praktis, suhu sedikit di
atas titik didih rata-rata hasil sampel dalam waktu elusi dari 2-30 menit. Suhu Minimal
memberikan resolusi yang baik, tetapi meningkatkan waktu elusi. Jika sampel memiliki
rentang didih lebar, maka pemrograman suhu dapat berguna. Suhu kolom meningkat (baik
terus menerus atau dalam langkah-langkah) sebagai hasil pemisahan.

detektor

Ada banyak detektor yang dapat digunakan dalam kromatografi gas. Detektor yang berbeda
akan memberikan berbagai jenis selektivitas. Sebuah detektor non-selektif menanggapi
semua senyawa kecuali gas pembawa, detektor selektif menanggapi berbagai senyawa
dengan properti fisik atau kimia umum dan detektor khusus menanggapi senyawa kimia
tunggal. Detektor juga dapat dikelompokkan menjadi konsentrasi detektor tergantung dan
aliran massa tergantung detektor. Sinyal dari konsentrasi detektor terikat adalah terkait
dengan konsentrasi zat terlarut dalam detektor, dan biasanya tidak merusak sampel
Pengenceran dengan gas make-up akan menurunkan respon detektor. Aliran massa tergantung
detektor biasanya menghancurkan sampel, dan sinyal terkait dengan tingkat di mana molekul
zat terlarut masuk detektor. Respon dari aliran tergantung detektor massa tidak dipengaruhi
oleh gas make-up.

Air buangan dari kolom dicampur dengan hidrogen dan udara, dan dinyalakan. Senyawa
organik terbakar dalam nyala menghasilkan ion dan elektron yang dapat menghantarkan
listrik melalui api. Sebuah potensi listrik yang besar diterapkan pada ujung burner, dan
elektroda kolektor terletak di atas api. Arus yang dihasilkan dari pirolisis dari setiap senyawa
organik diukur. Jumlah besar secara massal sensitif daripada konsentrasi sensitif; ini
memberikan keuntungan bahwa perubahan laju alir fase gerak tidak mempengaruhi respon
detektor. The FID adalah detektor umum yang berguna untuk analisis senyawa organik;
memiliki sensitivitas tinggi, berbagai respon linear besar, dan kebisingan yang rendah. Hal ini
juga kuat dan mudah digunakan, tapi sayangnya, ia menghancurkan sampel.
http://teaching.shu.ac.uk/hwb/chemistry/tutorials/chrom/gaschrm.htm

Penggunaan kromatografi gas ( gc ) :

Penentuan morfin dan kodein dalam urine manusia dengan kromatografi gas

Spektrometri massa
Analisis beberapa konstituen bioaktif dari Mussaenda frondosa linn dengan GC-MS
Kromatografi Gas di Lingkungan Ilmu dan Evaluasi Bioremediasi
Kapiler Gas Chromatography Analisis Perubahan kimia selama Fermentasi Kubis

(Brassica oleracea varietas capitata) Juice

Penerapan gas kromatografi-olfactometry (GC-O) di analisis dan kualitas penilaian
minuman beralkohol

Menganalisis Pelarut Sisa Produk farmasi Menggunakan GC Headspace dengan

Valve-dan-loop Sampling
Pelarut Residual dan Berbagai Efektif Teknik kromatografi gas dalam Analisis pelarut
sisa