K R O M ATO G R A FI

K O LO M
K O N V EN S IO N A L

Dosen Pembimbing :
Arif Sholahuddin, S.Pd, M.Si.
Drs. Abdul Hamid, M.Si.

LATAR BELAKANG
Kromatografi digunakan untuk memisahkan

substansi campuran menjadi komponen-komponen

molecular.
Semua kromatografi memiliki fase diam

LATA R B ELA K A N G

(dapat berupa padatan, atau kombinasi cairanpadatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas).
Kromatografi ini dikembangkan menjadi beberapa

jenis, yaitu kromatografi lapis tipis, kromatografi

kertas, kromatografi gas dan kromatografi kolom.

Jenis-Jenis Kromatografi
1. Kromatografi cair-padat (Kromatografi
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.

Adsorpsi)
Kromatografi Cair-cair (Kromatografi Partisi)
Kromatografi Gas-padat (KGP)
Kromatografi Gas-Cair (KGC)
Kromatografi Penukar Ion
Kromatografi Kertas (KT)
Kromntografi Lapis Tipis (KLT atau TLC =
Thin Layer Chromatography)
Kromatografi Filtrasi Gel
Kromatografi Elektroforesis Kontinyu

Lanjutan...
Ditinjau
dari
mekanismenya
kromatografi
kolom
merupakan
kromatografi serapan atau adsorbsi.
Kromatografi
kolom
digolongkan
kedalam kromatografi cair padat (KCP)
kolom terbuka.

Sejarah Penemuan dan

Perkembangan Alat Kromatograf
Mikhail Semyonovich Tsvet Seorang botanist
Rusia, pada tahun 1900 menemukan teknik
kromatografi untuk pertama kali melalui riset
pada klorofil.
Pada 1952 Archer John Porter Martin dan
Richard
Laurence
Millington
Synge
memenangkan anugerah Nobel bidang Kimia
untuk temuannya mengenai kromatografi
partisi.
Penemu Alat Kromatografi adalah Tswett yang
pada tahun 1930, mencoba memisahkan
pigmen-pigmen
dari
daun
dengan
menggunakan suatu kolom yang barisi kapur

Lanjutan
Penyelidikan tentang kromatografi kendor
untuk beberapa tahun sampai digunakan
suatu teknik dalam bentuk kromatografi
padatan cair (LSC)
Pada tahun 1938 Alat kromatografi lapisan
tipis (TLC) oleh Izmailov dan Schreiber, dan
kemudian diperhalus oleh Stahl pada tahun
1958
Tahun 1941 Martin dan Synge tidak hanya
mengubah dengan cepat alat kromatografi
cair tetapi seperangkat umum langkah untuk
pengembangan alat kromatografi gas dan alat
kromatografi kertas.
Di Indonesia, alat ini diperkenalkan pada
tanggal 4-5 Juni 1979 di Lembaga Kimia

Defnisi Kromatograf
kolom
Sebenarnya

kromatografi

kolom

merupakan

teknik kromatografi yang paling awal yang

pertamakali di lakukan oleh D.T.Davy (1987)
yaitu untuk membedakan komposisi minyak
bumi. Ditinjau dari mekanismenya kromatografi
kolom merupakan kromatografi serapan atau
adsorbsi.

Jenis metode kromatograf

kolom
Berdasarkan interaksi
komponen dengan
adsorben
Kromatografi

Berdasarkan gaya yang bekerja

pada kolom
Kromatograf

Berdasarkan jenis fasa diam dan fasa

gerak
Kromatografi Fase Normal

Bagian-Bagian Krom atografi

Kolom

Adsorben Dan Pelarut Dalam

Kromatograf Kolom
Adsorben
Silika gel (SiO2) dan alumina (Al2O3)
adalah 2 adsorben yang paling umum
digunakan untuk kromatografi kolom
Ukuran partikel dari adsorben sangat
mempengaruhi
bagaiman
eluen
bergerak melewati kolom.

Lanjutan

Partikel yang lebih kecil digunakan untuk

kromatografi
kolom
tekanan
sedangkan
adsorben partikel yang lebih besar digunakan
untuk komatografi kolom gravitasi.
Selain silika gel dan alumina adsorben yang
digunakan
dalam
kromatografi
kolom
diantaranya arang, magnesium silikat,kalsium
sulfat dan serbuk selulosa.

Pelarut
Pelarut mempunyai peranan yang
penting dalam mengelusi sampel yang
dapat
menentukan
keberhasilan
pemisahan secaa kromatografi kolom.
Pelarut yang mampu menjalankan elusi
terlalu
cepat
tidak
akan
mampu
mengadakan pemisahan yang sempurna.
Sebaliknya elusi yang terlalu lambat akan
menyebabkan waktu retensi yang terlalu
lama

Lanjutan
Sistem
pelarut
dengan
kepolaran
yang
bertingkat sering juga digunakan adalah pelarut
mengelusi kolom.
Beberapa jenis pearut yang sering digunakan
dalam kromatografi kolom:
Eter, minyak tanah, Karbon tetra klorida,
Sikloheksan, Karbon disulfida, Eter, Aseton,
Benzen, Ester, Kloroform, Alkohol, Air, etanol,
metanol, petroleum benzen

Syarat-syarat Adsorben dan

Pelarut
Pelarut:
Adsorben:
pelarut
1. Harus
memiliki 1. Pemilihan
tergantung dari sifat
luas
permukaan
kelarutan
dan
besar
kepolarannya
2. Harus
mudah 2. Mencoba dengan KLT,
cara
ini
dikerjakan
diregenerasi
dengan memilih fase
3. Tidak
cepat
diam
KLT
sejenis
kehilangan
dengan
fase
diam
kolom
yang
akan
kapasitas serap
digunakan.

Contoh lain zatpenyerap dan fase gerak

ZAT PENYERAP

FASE GERAK

Sukrosa

Eter minyak tanah

Pati

Karbon tetra klorida

Inulin

Sikloheksan

Talk

Karbon disulfida

Natrium Karbonat

Eter

Kalsium Karbonat

Aseton

Kalsium Fosfat

Benzen

Magnesium Karbonat

Ester

Magnesium Oksida

Ester

Kalsium Hidroksida

Kloroform

Magnesium silikat aktif

Alkohol

Alumina aktif

Air

Arang aktif

Piridin

Prinsip K erja K rom atograf i

K olom K onvensional
Prinsip kerja kromatografi kolom adalah
adanya perbedaan daya serap dari
masing-masing komponen, campuran
yang akan diuji, dilarutkan dalam
sedikit pelarut lalu dimasukkan lewat
puncak kolom dan dibiarkan mengalir
kedalam zat menyerap.

Cara Penyiapan Kolom

Cadangan Fase
Gerak

Fase Gerak
Kertas saring atau
bahan penyaring
Bahan penyaring bila perlu
Sumbatan kapas atau serabut gelas
Labu Penampung

Pemilihan Kolom
Pada pemilihan ukuran kolom harus diperhitungkan
jumlah contoh.
1. Perbandingan bobot zat penyerap dan contoh
2. Perbandingan panjang kolom dengan diameter
3. Untuk

contoh multi komponen dan contoh

komponen-komponennya mempunyai afinitas yang
sama terhadap zat penyerap digunakan kolom
panjang

4. Untuk

contoh
komponen
yangmempunyai
afinitas berbeda terhadap zat penyerap digunakan
kolom pendek

Cara memasukkan
Metode
zat penyerap ke
dalam kolom

C ara P enggunaan K olom

Senyawa
biru lebih polar
daripada senyawa kuning dan
memungkinkan
mempunyai
kemampuan berikatan dengan
hidrogen.
Proses
pencucian
senyawa melalui kolom
menggunakan
pelarut
dikenal sebagai elusi,
sedangkan
pelarut
disebut sebagai eluen.

Kromatograf Kolom Pada Sampel

Berwarna

ALAT OTOMATIS PENGUMPULAN

SAMPEL PADA KROMATOGRAFI KOLOM
1.Fraction Collector C660
Mengumpulkan bahan
yang dipisahkan
menurutwaktu, volume
ataupun puncak. Selama
beroperasi,
sampaidengan 12 liter
dapat dikumpulkan
maksimal dalam240
tabung reaksi.

2. Flash KromatografOtomatis-Pengendalian
dengan komputer (SepacoreControl Software)

Menyediakan otomatisasi penuh dengan

fleksibilitas optimal untuk interaksi in-run,
perangkat lunak ini memungkinkan
pemurnian yang cepat dengan kinerja tinggi.

Keuntungan dan Kelemahan

Kromatograf Kolom Konvensional
Keuntungan :
Digunakan untuk memisahkan atau memurnikan zat-zat yang
terkandung dalam campuran.

Kerugian :
1. Membutuhkan waktu dalam pengerjaannya dan

membutuhkan keahlian yang baik.

2. Selalu diperhatikan perubahan dalam pengerjaannya.
3. Prosedurnya rumit terlebih untuk sampel dalam jumlah

banyak.

Aplikasi Penggunaan
Kromatografi Kolom

Ekstraksi, Pem urnian, dan Studi

m engenaisifat antioksidan fucoxantin
pada rum put laut coklat
Tujuan : untuk memperkirakan pigmen yang terdapat pada lima jenis rumput
laut coklat
Persiapan sampel : Sampel bubuk rumput laut diekstraksi dengan
melarutkan dalam 10ml dari 3 pelarut seperti aseton 90%, aseton 100% , dan
etanol 90%.
Kromatografi lapis tipis
Digunakan untuk menghitung nilai Rf pada fotosintesis pigment klorofil,
karoten, dan fucoxantin yang terdapat dalam sampel
Kromatografi kolom
Fase diam berupa Silika gel (230-400 mesh) dicampur dengan pelarut yaitu nheksana sebagai adonan. Fase gerak berupa n-heksana dan aseton
perbandngan 7:3.

Uji Aktivitas Antioksidan Dengan Metode

DPPH
Uji aktivitas antioksidan dilakukan setelah uji
peredaman radikal bebas terdeteksi pada
beberapa sampel.

Column Chromatography Purifed

Phytochemicals Identifed in
Phragmytes vallatoria Leaf Ethanolic
Extract
Tujuan :
Ekstrak daun Phragmytes vallatoria diaplikasikan sebagai penyembuh
luka. Cara analisis GC-MS dari ekstraksi daun Phragmytes vallatoria
dengan menggunakan etanol menunjukkan adanya asam lemak dan
senyawa plasticizer. Oleh karena itu,telah dilakukan penelitian pada
ekstrak daun menggunakan metode fitokimia dan dapat dilakukan dengan
sederhana menggunkan kromatografi kolom.
Hasil dan Pembahasan :
Berdasarkan penelitian didapatkan hasil bahwa ekstrak daun Phragmytes
vallatoria mengandung antioksidan, asam lemak dan senyawa plasticizer
melalui metode fitokimia. Teridentifikasinya asam linoleat diketahui
memiliki fungsi dapat melindungi membran sel dari senyawa berbahaya.

Isolasidan Identif k
iasisenyaw a Terpenoid
yang A ktif A ntibakteriPada H erba
M eniran (Phyllanthus niruriLinn)
Tujuan : Untuk mengetahui ada tidaknya herba
meniran
(Phyllanthus
niruri
Linn)
mengandung senyawa terpenoid antibakteri
Prosedur :
a. Ekstraksi: dilakukan dengan 2 cara, yaitu
Soxletasi dan Maserasi
b. Uji aktivitas antibakteri : Ekstrak nheksanaa diuji aktivitasnya terhadap bakteri
Eschericia coli dan Staphyloccocus aureus

Hasil dan Pembahasan:

Hasil ekstraksi cara sokletasi dan maserasi
menunjukkan
ekstrak
n-heksana
positif
mengandung senyawa terpenoid dengan
terbentuknya warna ungu setelah direaksikan
dengan Pereaksi Lieberman Burchard.
Hasil uji aktivitas antibakteri terhadap
ekstrak n-heksana hasil sokletasi dipisahkan
mengunakan
kromatografi
kolom
No
Fraksi
Jumlah
Rf
Warna
menghasilkan tiga buah
Noda fraksi
Ekstrak
1

A (1-27)

0,725

Kuning

B (28-33)

0,690 dan

Kuning Muda

0,600
3

C (34-)

0,580

Kuning Muda

Hasil uji fitokimia masing-masing fraksi hasil

kromatografi kolom
Nama

Warna larutan

Warna larutan

Fraksi

sebelum

setelah

direaksikan

direaksikan

Keterangan

dengan pereaksi dengan pereaksi

Liberman-

Liberman-

Burchard
Kuning Muda

Burchard
Merah Muda

+ terpenoid
(diterpenoid)

Kuning Muda

Hijau Kebiruan

- (steroid)

Kuning

Ungu Muda

+
(triterpenoid)

Isolation, Purif c
iation and Identif c
iation
of Curcum inoids from Turm eric
(Curcum a longa L.) by Colum n
Chrom atography
Tujuan

: Penelitian ini berfokus pada penyaringan

pelaruk untuk mengekstrak Kurkuminoid, mengisolasi
dan memurnikan kurkuminoid menggunakan krmatografi
kolom di sertai analisis permurnian dengan HPLC.

Prosedur :
Preparasi Sampel
Kondisi Kromatografi
Pemisahan kukuminoid

system perbedaan pelarut

Kromamatografi Kolom

dengan

KLT

menggunakan

 Hasil dan Pembahasan :

Berdasarkan
penelitian
kromatografi
kolom
diketahui aseton sebagai pelarut yang cocok untuk
mengektrak Kurkuminoid. Dengan menggunakan
HPLC analisis selanjutnya diketahui kurkuminoid
menunjukkan adanya kurkumin dan menunjukkan
adanya
Demethoxycurucmin
(DMC)
dan
(Bisdemethoxycurcumin) BDMC dengan persentase
22,8%, 14,2%, 6,5%.

KarakterisasiSenyaw a Flavonoid H asilIsolat

dariFraksiEtilAsetat D aun M atoa (Pom etia
pinnata J.R.Forst & G .Forst)
Tujuan

: Mengidentifikasi karakteristik senyawa

flavonoid hasil isolat dari fraksi Etil Asetat Daun
Matoa.

Prosedur :

1. maserasi sampel
2.melakukan pemurnian dengan fraksinasi dan
kromatografi
3. Fraksi etil asetat dimurnikan dengan kromatografi
kolom vakum cair dan kromatografi kolom tekan
menggunakan fasa diam silika gel

4. Senyawa yang diperoleh kemudian dimurnikan

dengan menggunakan KLT preparatif dua dimensi
perbandingan eluen n-heksana : etil asetat (8:2)
5. Ekstrak yang relatif murni dianalisis dengan
spektrofotometer UV-Vis dan spektrofotometer
Inframerah (IR).

H A SIL
1. Ekstraksi Senyawa Flavonoid

 2. Pemisahan dan Pemurnian

 3. Pemurnian

4. Uji Kemurnian
Uji kemurnian terhadap isolat F3.5
dengan
berbagai
fase
gerak
menunjukkan adanya noda tunggal
dengan demikian dapat dianggap
bahwa isolat tersebut terdiri dari satu
komponen senyawa yang relatif murni
secara KLT. Hasil KLT 2 dimensi
diperoleh nilai Rf I = 0,20 dan Rf II =
0,24.

5.K arakterisasiSenyaw a H asilIsolat

Tetapan Fisika Isolat F3.5

Pengukuran titik leleh dari senyawa

hasil isolatsebesar 113-115oC, hal ini

menunjukan bahwa hasil isolasi yang
diperoleh relatif murni.

 Spektrofotometri UV-Vis

Keterangan :* =menunjukkan panjanggelombangmaksimum

= menunjukkan pergeseran

 Spektrofotometri Inframerah

 Dari hasil penelitian yang diperoleh dapat

disimpulkan bahwa isolat F3.5 relative murni

diduga termasuk senyawa flavonoid karena
pada spektrum UV-Vis menunjukkan pada pita
I 310 nm dan 270 nm pada pita II, dan pada
spektrum IR mempunyai gugus fungsi O-H
aromatik, C-H alifatik, C=O karbonil, C=C
aromatik dan C-C aromatik.

SESI DISKUSI

KESIM PU LAN
Kromatografi

kolom merupakan kromatografi

serapan atau adsorbsi.
Prinsip dari permisahan komponen-komponen
adalah adsorpsi diantara permukaan padatan cairan (solid liquid interface). Supaya didapatkan
permisahan
yang
baik.
senyawa-senyawa
didalam campuran harus mempunyai afinitas
yang berbeda terhadap Zat penyerap dan harus
ada saling interaksi di antara zat penyerap dan
komponen. Pada saat zat penyerap yang
ditambah
dengan
contoh
dialiri
pelarut.
komponen-komponen didalam campuran akan
bergerak turun dengan kecepatan tertentu.