BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang
KLT Preparatif adalah metode isolasi yang sudah lama popular karena
metode ini telah digunakan secara universal oleh mahasiswa dan
penelitian-penilitian bahan alam. Selain itu, metode ini tidak memerlukan
biaya pengerjaan yang mahal. KLT Preparatif merupakan proses isolasi
yang terjadi berdasarkan daya serap dan daya partisi serta kelarutan dari
komponen-komponen kimia yang akan bergerak mengikuti kepolaran
eluen dengan daya serap adsorben terhadap komponen kimia yang tidak
sama, maka komponen bergerak dengan kecepatan yang berbeda
sehingga hal ini menyebabkan pemisahan. KLT Preparatif dapat
digunkaan untuk memisahkan bahan dalam jumlah gram, namun
sebagian besar pemakaian hanya dalam jumlah milligram (Kristanti,
2008). Kelebihan dari penggunaan KLT Preparatif adalah biaya yang
digunakan murah dan memakai peralatan yang sederhana. Sedangkan
kekurangan dari KLT Preparatif yaitu memungkinkan adanya senyawa
yang diambil dari plat adalah senyawa beracun, waktu yang diperlukan
dalam proses pemisahan cukup panjang, adanya pencemar setelah
proses ekstraksi senyawa dari adsorben dan biasanya rendemen yang
diperoleh berkurang 40%-50% dari bahan awal (Kristanti, 2008). Pada KLT
Preparatif terdapat fase diam dan fase gerak seperti pada KLT biasa. Dimana fase diamnya
adalah sebuah plat dengan ukuran ketebalan bervariasi. Untuk jumlah sampel 10-100 mg,
dapat dipisahkan dengan mengunakan KLT Preparatif dengan adsorben silika gel atau
aluminium oksida, dengan ukuran 20x20 cm dan tebal 1 mm, jika tebalnya di dua kalikan,
maka banyaknya sampel yang dapat dipisahkan bertambah 50%, seperti halnya KLT biasa,
adsorben yang paling umum digunakan pada KLT Preparatif adalah silika gel (Kristanti,
2008).

1
1.2 Rumusan Masalah
Bagaimana cara mengisiolasi senyawa kimia dari ekstrak bahan alam dengan menggunak
an plat KLT Preparative ?

1.3 Tujuan
Mengetahui serta mampu mengisolasi senyawa kimia dan Ekstrak bahan alam dengan
mengggunakan KLT preparative.

2
 BAB II

DASAR TEORI

Kromatografi lapis tipis merupakan proses pemisahan campuran dengan media lapis tipis
berdasarkan perbedaan-perbedaan tertentu yang dimiliki oleh senyawa yang akan dipisahkan.
Perbedaan yang dapat dimanfaatkan salah satunya sifat kepolaran. Fase gerak membawa
komponen suatu campuran melalui fase diam, dan fase diam akan berikatan dengan komponen
tersebut dengan afinitas yang berbeda-beda.

Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP) adalah salah satu metode yang memerlukan
pembiayaan murah dan memakai peralatan dasar. Walaupun KLTP dapat memisahkan bahan
dalam jumlah gram, sebagian besar pemakaiannya hanya dalam jumlah milligram. Ketebalan
penyerap (adsorben) yang paling sering dipakai pada KLTP adalah sekitar 0,5-2 mm. ukuran plat
kromatografi biasanya 20x20 cm. pembatasan ketebalan lapisan dan ukuran pelat sudah tentu
mengurangi jumlah bahan yang dapat dipisahkan dengan KLTP. Penyerap paling umum
digunakan ialah silika gel dan dipakai dipakai untuk pemisahan campuran senyawa lipofil
maupun campuran senyawa hidrofil (Hostettmann, 2006). Pada saat pengerjaan dilakukan
cuplikan sampel dalam bentuk cair pada pelat, ditotolkan berupa garis atau pita yang harus
sesempit mungkin karena pemisahan tergantung pada lebar pita, pada salah satu sisi pelat lapisan
besar dan dikembangkan secara tegak lurus pada garis cuplikan sehingga campuran akan terpisah
menjadi beberapa pita.

Proses isolasi KLTP terjadi perbedaan daya serap dan daya partisi serta kelarutan dari
komponen-komponen kimia yang akan bergerak mengikuti kepolaran eluen, oleh karena daya
serap adsorben terhadap komponen kimia tidak sama, maka komponen bergerak dengan
kecepatan yang berbeda sehingga hal inilah yang menyebabkan pemisahan (Munson, 2010).

3
 KLTP klasik memiliki beberapa kekurangan, kekurangan yang utama adalah
pengambilan senyawa dari pelat yang dilakukan dengan pengekstraksian dari penyerap. Jika
senyawa beracum harus dikerok dari pelat, dapat menimbulkan masalah serius. Kekurangan yang
lainnya ialah jangka waktu yang diperlukan untuk pemisahan cukup panjang, adanya pencemar
dan sisa dari pelat sendiri setelah pengektraksian pita yang mengandung senyawa yang
dipisahkan dengan pelarut.

4
 BAB III

METODOLOGI PRAKTIKUM

3.1 Alat dan Bahan

Alat

- Oven
- Pelat kaca ukuran 10 × 10 cm
- Erlenmeyer
- Tabung reaksi
- Plat KLT
- Pipa kapiler
- Chamber
- Lampu UV

Bahan

- Sampel uji : fraksi hasil kolom kromatografi

- Silica gel G atau GF254
- N- heksan
- Air suling
- Etil asetat

3.2 Prosedur Kerja

I. Pembuatan lapisan silica gel atau GF254

5
 1. Timbang silica gel atau GF254 untuk KLT sebanyak 30 gram
2. Dimasukkan ke dalam Erlenmeyer bertutup dengan volume 250mL
3. Ditambahkan air suling kurang lebih 60 mL, kemudian di kocok selama 90 detik,
sehingga diperoleh suspensi
4. Suspensi fluida segera dituangkan ke dalam penyaput dan disaputkan seragam
dengan satu arah gerakan yang lancer
5. Jumlah diatas dapat melapisi 3 plat kaca 10 × 10 cm dengan ketebalan lapisan
0,3mm
6. Plat kaca yang sudah dilapisi dikeringkan dengan membiarkannya semalam (8-12
jam) di dalam ruangan dan kemudian digunakan dalam keadaan kering udara
7. Plat kaca basah dapat juga dikeringkan dahulu selama 15 menit dengan kipas dan
kemudian diaktifkan selama 30 menit didalam oven dengan suhu 110C dengan
posisi tegak di dalam rak pengering
8. Plat kering disimpan ditempat yang tidak lembab dan bebas dari uap
laboratorium

II. kromatografi lapis tipis fraksi hasil isolasi

1. Larutan cuplikan dilarutkan dalam pelarut yang sesuai

2. Beri batas atas dan bawah pada plat KLT sepanjang 1 cm
3. Larutan sampel ditotolkan dengan menggunakan pipa kapiler ke plat KLT dari
ujung ke ujung sampai terbentuknya sebuah pita
4. Siapkan larutan eluen yang sesuai di dalam chamber dan jenuhkan menggunakan
kertas saring
5. Dimasukkan plat KLT ke dalam chamber dan biarkan proses pemisahan terjadi
sampai bidang batas atas
6. Angkat plat KLT dan keringkan di udara
7. Dilakukan pengamatan di bawah lampu UV dengan panjang gelombang 254 dan
365 nm, dan tandai pita yang teramati
8. Lakukan pengikisan pada tiap pita dan pisahkan hasil pengikisan pita tersebut
9. Ekstraksi hasil pengikisan dengan menggunakan pelarut yang sesuai

III. isolasi hasil ektraksi dengan kromatografi lapis tipis preparative

6
 1. Hasil pengikisan yang telah dilarutkan dengan pelarut yang sesuai diisolasi
dengan
menggunakan pipet tetes yang bagian bawahnya diberi kapas
2. Hasil pelarutan dimasukkan kedalam pipet
3. Pada bagian bawah pipet disiapkan wadah untuk menampung filtrat
4. Filtrat dilakukan pengujian dengan menggunakan plat KLT
5. Sampel ditotolkan pada KLT
6. Chamber diisi dengan eluen yang sesuai dan dijenuhkan menggunakan kertas
saring
7. Setelah jenuh, plat KLT dimasukkan kedalam chamber dan tunggu eluen naik
sampai batas atas
8. Kemudian diangkat dan dikeringkan, dan diamati dibawah lampu UV dengan
panjang gelombang 254 dan 365 nm

7
 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 HASIL PENGAMATAN

No Pengamatan Hasil
1 Silica GF254-> ditimbang 30 gram dan dimasukkan
kedalam labu erlenmater, lalu ditambahkan aquadest
55 ml,disebarkan pada plat kaca, dikeringkan pada
oven yang bersuhu 110c selama 30 menit

Nomor vial yang digabungkan dari Urutan

Gambar
Kromatografi Kolom nomor vial
2 1
8 + 14 2
20 3
26 4
32 5
38+44+50 6
56+62 7
68+73 8

a. Hasil pengamatan KLT penggabungan penggabungan vial pada sinar UV

Eluen pertama = Heksan : Etil = 4 : 1 (Tidak naik)

8
 Gambar Keterangan

Pengamatan KLT 8 vial pada UV 254 nm

dengan eluen heksan : etil = 4 : 1 (tidak
naik)

Eluen kedua = Heksan : Etil = 3 : 7 (Naik)

Gambar Keterangan

Pengamatan KLT 8 vial pada gelombang

UV 254 nm dengan eluen heksan : etil =
3 : 7 (naik)

Hasil pemanasan setelah pewarnaan

dengan godin A dan godin B

b. Hasil pengamatan setiap KLT preparatif di bawah sinar UV 254 nm dan 365 nm
Nomor vial yang dipakai untuk KLT preparatif = vial 1, vial 2, dan vial 4
Eluen = Heksan : Etil = 3 : 7

9
Gambar Keterangan Jumlah baris yang
dikerok

Pengamatan hasil
KLT preparatif 1
pada sinar UV 254
nm

1 (warna kecoklatan)

Pengamatan hasil
KLT preparatif 1
pada sinar UV 365
nm

2 (warna kekuningan
dan kecoklatan)

Pengamatan hasil
KLT preparatif 2
pada sinar UV 254
nm

10
 Pengamatan hasil
KLT preparatif 2
pada sinar UV 365
nm

Pengamatan hasil
KLT preparatif 3
pada sinar UV 254
nm

1 (warna keabuan)

Pengamatan hasil
KLT preparatif 3
pada sinar UV 365
nm

*keterangan: fluoresensi warna biru menunjukkan pelarut

c. Hasil pengamatan setiap fraksi dari masing-masing KLT preparatif
Eluen = Heksan : Etil = 3 : 7
Gambar Keterangan

Hasil penandaan bercak fraksi

KLT preparatif 1 dan 2, muncul
masing-masing 2 bercak pada
KLT 1 dan KLT 2, namun pada
KLT 2 tidak cukup terjadi
pemisahan

11
 Hasil pengamatan bercak fraksi
KLT preparatif 3 setelah
pewarnaan godin A dan godin B
pemanasan (tidak muncul bercak)

Lampiran
Gambar Keterangan

Vial yang ditotolkan ke KLT

Penotolan dari 8 vial yang

digabung pada Kromatografi
Kolom

Pengamatan KLT 8 vial pada UV

254 nm dengan eluen heksan :
etil = 4 : 1 (tidak naik)

12
 Pengamatan KLT 8 vial pada
gelombang UV 254 nm dengan
eluen heksan : etil = 3 : 7 (naik)

Hasil pemanasan setelah

pewarnaan dengan godin A dan
godin B

Penimbangan silica gel 60 GF

254

Pelat kaca preparatif sebelum

ditabur silica gel 60 GF 254

Pelat kaca preparatif setelah

ditabur silica gel 60 GF 254

13
 Penotolan bercak pada KLT
Preparatif

Proses elusi KLT Preparatif

Pengamatan hasil KLT preparatif

1 pada sinar UV 254 nm

Pengamatan hasil KLT preparatif

1 pada sinar UV 365 nm

14
 Pengamatan hasil KLT preparatif
2 pada sinar UV 254 nm

Pengamatan hasil KLT preparatif

2 pada sinar UV 365 nm

Pengamatan hasil KLT preparatif

3 pada sinar UV 254 nm

Pengamatan hasil KLT preparatif

3 pada sinar UV 365 nm

15
 Pengamatan hasil fraksi KLT
Preparatif 1 pada UV 254 nm

Pengamatan hasil fraksi KLT

Preparatif 1 pada UV 365 nm

Pengamatan hasil fraksi KLT

Preparatif 2 pada UV 254 nm

Pengamatan hasil fraksi KLT

Preparatif 2 pada UV 365 nm

16
 Hasil penandaan bercak fraksi
KLT preparatif 1 dan 2

Pengamatan hasil fraksi KLT

Preparatif 3 pada UV 254 nm
(tidak muncul bercak)

4.2 PEMBAHASAN

Pada praktikum ini dilakukan percobaan Kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP).
Dimana pada KLT preparatif pada dasarnya sama dengan kromatografi lapis tipis biasa,
namun perbedaan yang nyata ialah pada KLT preparatif menggunakan lempeng kaca yang
besar (ukuran 20 x 20 cm) dengan ketebalan yang sering dipakai adalah 0,5 -2 mm dan
sampel ditotolkan berupa garis lurus pada salah satu sisi lempeng. Pembatasan ketebalan
ukuran lapisan dan ukuran pelat sudah tentu mengurangi jumlah bahan yang dapat
dipisahkan dengan KLT Preparatif. KLT Preparatif dapat digunakan untuk memisahkan
bahan dalam jumlah gram, namun sebagian besar pemakaian hanya dalam jumlah milligram.
KLT preparatif dilakukan dengan menggunakan lapisan tebal (sampai 1 mm) sebagai
pengganti lapisan penyerap yang tipis (Nasution, 2010).

KLT Preparatif memiliki kelebihan dan kekurangan. Kelebihan dari penggunaan KLT
Preparatif adalah biaya yang digunakan murah dan memakai peralatan paling dasar.
Sementara kekurangannya antara lain : adanya kemungkinan senyawa yang diambil dari plat
adalah senyawa beracun, waktu yang diperlukan dalam proses pemisahan cukup 72 panjang,

17
adanya pencemar setelah proses ekstraksi senyawa dari adsorben dan biasanya rendemen
yang diperoleh berkurang dari 40-50% dari bahan awal (Kristanti, 2008). Seperti halnya
KLT secara umum, KLT Preparatif juga melibatkan fase diam dan fase gerak. Dimana fase
diamnya adalah sebuah plat dengan ukuran ketebalan bervariasi. Adsorben yang paling
umum digunakan pada KLT Preparatif adalah silika gel yang dipakai untuk pemisahan
campuran lipofil maupun senyawa hidrofil (Hostettmann, 1995).

Pada praktikum kali ini, fase diam yang digunakan adalah plat silika gel GF254. Maksud
dari angka 254 adalah plat akan menampakkan noda atau bercak pada saat disinari dengan
UV

254 nm, dan jika disinari dengan sinar UV 356 nm, maka plat akan nampak gelap dan
noda pun akan tampak gelap juga. Silika gel GF254 artinya silika gel yang terdapat pada plat
KLT yaitu gypsum dengan fluoresensi pada panjang gelombang 254 nm karena adanya
kromofor. Sebanyak 30 gram fase diam berbentuk serbuk silika gel GF254 ditambahkan
aquades sebanyak 60 mL kemudian diaduk hingga menjadi seperti bubur. Kemudian dituang
dan diratakan diatas 3 lempeng kaca ukuran 20X20 cm, dalam waktu tidak lebih dari 4
menit. Setelah lapisan bubur ini mengering di ruangan selama kurang lebih satu minggu,
sebelum plat akan digunakan plat dipanaskan terlebih dahulu di dalam oven pada 105°C
selama 30 menit, dengan tujuan semua air akan menguap. Proses pengeringan atau
penghilangan air ini disebut proses mengaktifkan plat kromatografi (fase diam), selanjutnya
diamkan pada suhu ruang.

Selain membuat lapisan fase diam KLT preparatif, kami juga melakukan analisa terhadap
vial-vial sampel hasil penggabungan fraksi kromatografi kolom dengan menggunakan
metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT) untuk mengetahui sampel dari vial mana yang akan
digunakan untuk KLT preparatif. Dilakukan penotolan sampel dari masing-masing vial hasil
penggabungan di atas plat KLT, kemudian di elusi di dalam chamber dengan menggunakan
pelarut n-heksana dan etil asetat dengan perbandingan 4:1. Dari hasil KLT tersebut
dipilihlah sampel dari gabungan vial 41 dan 47-48 kemudian terdapat noda yang terbentuk
yaitu warna kecoklatan yang terbentuk terpisah membentuk bulatan-bulatan di atas fase
diam dan tidak membentuk tailling seperti sampel yang lain.

18
 Selanjutnnya dilakukan kromatografi menggunkan klt preparative diatas teknik
pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam
medium tertentu. Pada kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua
fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam akan menahan komponen campuran
sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudah
tertahan pada fase diam akan tertinggal, sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase
gerak akan bergerak lebih cepat. Proses isolasi kromatografi preparative terjadi berdasarkan
perbedaan daya serap daya partisi serta kelarutan dari komponen kimia yang akan bergerak
mengikuti kepolaran eluen, oleh karena daya serap adsorben terhadap komponen kimia yang
tidak sam, maka komponen bergerak dengan kecepatan yang berbeda sehingga hal inilah
yang menyebabkan pemisahan (Nasution, 2010).

Pengerjaan pertama dalam pemisahan ini adalah dengan menyiapkan alat dan bahan yang
akan digunakan agar dapat mengefektifkan waktu dan memudahkan dalam proses
pengerjaannya. Penyiapan fase gerak dengan perbandingan 4:1 (etilasetat : n-heksan) sesuai
dengan identifikasi fase gerak yang cocok saat kromatografi lapis tipis analitik. Hal ini
dilakukan agar mendapatkan fraksi yang baik atau sampel terlusi dengan baik.

Sampel yang digunakan adalah hasil fraksi n-heksan yang telah dipisahkan dengan
metode kromatografi kolom dan penggabungan hasil vial berdasarkan persamaan Rf yang
dihasilkan. Vial yang dipilih adalah vial gabungan 41 dan vial gabungan 47-48. Kemudian
sampel yang telah dilarutkan dalam sedikit pelarut (n-heksan) ditotolkan secara
berkelanjutan dengan pipa kapiler sesempit mugnkin hingga membentuk pita horizontal
yang sejajar. Kemudian dimasukan klt preparative kedalam chamber berisi eluen yang telah
dijenuhkan menggunakan kertas saring. Klt preparative diambil segera saat eluen mencapa
atas batas klt preparatif yang telah ditentukan . karena makin lama senyawa kontak dengan
adsorben, maka makin besar kemungkinan senyawa tersebut mengalami peruraian (Roy,
1991). Dilihat dibawah sinar UV 254 nm dan 365 nm untuk melihat pita yang terbentuk,
kemudian ditandai dan selajutnya bagian pita tersebut dikerok untuk mendapatkan isolatnya.

Untuk pemisahan isolate dengan lapisan silica yang tebawa, larutkan silica dengan n-
heksan, maka isolate yang berikatan dengan silica akan larut dalam n-heksan, kemudian
disaring. Dengan anggapan isolate telah larut pada larutan n-heksan, lapisan n-heksan

19
 dipisahkan dengan penyaring dari pipet yang telah dilapisi kapas dibawahnya untuk
menyaring silica-silika halus yang terbawa. Isolat dikumpulkan dalam vial dengan tiga kali
pembilasan dan dipisahkan dalam tiga vial yang berbeda, kemudian diperiksa kembali
menggunakan klt analitik untuk memastikan bahwa isolate mengandung senyawa yang
diinginkan

BAB V

PENUTUP

5.1 KESIMPULAN

Pada praktikum kali ini dilakukan percobaan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif dengan
menggunakan lempeng kaca yang besar (ukuran 20 x 20 cm) dengan ketebalan yang sering
dipakai adalah 0,5 -2 mm dan sampel ditotolkan berupa garis lurus pada salah satu sisi
lempeng. Sehingga didapatkan hasil isolate, kemudian diperiksa kembali menggunakan KLT
analitik untuk memastikan bahwa isolate mengandung senyawa yang diinginkan.

20
 DAFTAR PUSTAKA

Hostettmann, M., Hostettmann, K., Marston. A. Cara Kromatografi Preparatif. 1995. Bandung:

ITB

Kristanti, Alfinda Novi. 2008. Buku Ajar Fitokimia. Surabaya: Universitas

airlangga Press.

Munson. 2010. Plant Resources of South East Asia, Edible Fruits and Nuts. Bogor: Prosea

Foundation

Nasution. 2010. Pharmacochemical Investigation on Raw Materialsof Passiflora Edulis Forma

Flavicarpa. Planta Med.

Robinson, T. 1991. Kandungan Senyawa Organik Tumbuhan Tinggi. Diterjemahkan oleh Prof.

21
 Dr. Kosasih Padmawinata. Penerbit: ITB. Bandung

LAMPIRAN

22
23
24