LEMBAR KERJA PRAKTIKUM

Judul : Pemurnian (KLTP) dan Uji Kemurnian

Data Mahasiswa

Kelompok :1
Kelas/angkatan : Farmasi B / 2019
Anggota :
1. Ai Lutfitakyyah 24041119053
2. Elsa Martine Putri 24041119062
3. Intan Lestari Nur Hidayat 24041119071
4. Nabilla Az-Zahra 24041119080
5. Risma Girani Aprilia 24041119089
6. Siti Ajah Alawiah 24041119097
Instruksi

 Simaklah video tentang KLP dan KLT-2D yang disediakan

 Analisis dan pahami prosedur tersebut serta hasil yang diperoleh dari setiap
metode
 Jawablah pertanyaan di bawah ini berdasarkan pemahaman anda mengenai
metode pemurnian dan uji kemurnian

Pertanyaan

1. Apa tujuan dari proses pemurnian?

2. Jelaskan metode apa saja yang dapat digunakan untuk proses pemurnian!
3. Apa perbedaan dan persamaan KLT Preparatif dengan KLT Analitik? (Sajikan
dalam bentuk tabel)
4. Setelah diperoleh isolate murni, untuk memastikan kemurniannya perlu
dilakukan uji kemurnian. Metode apa saja yang dapat digunakan untuk uji
kemurnian?
5. Jelaskan masing-masing prosedur dan tujuan dari setiap metode uji kemurnian
tersebut!
6. Rancanglah prosedur pemurnian dan uji kemurnian yang dapat dilakukan terhadap
sampel yang anda miliki! (Buat dalam bentuk bagan alir)
 Jawab :

2. Metode yang digunakan dalam pemurrnian diantaranya sebagai berikut:

 Isolasi dengan metode Kromatografi Kolom Konvensional, isolasi secara kromatografi

kolom konvensional dengan fase diam berupa silica gel G.60 dan fase gerak
menggunakan cairan pengelusi n-heksan : etil asetat (3:7). Pemilihan fase gerak ini
didasarkan pada orentasi yang telah dilakukan sebelumnya menggunakan
kromatografi lapis tipis. Kolom dibebas lemakkan dengan cara membilas dengan
metanol, sumbat bagian bawah kolom dengan kapas. Silica gel disuspensikan dengan
nheksan yang telah disiapkan. Suspensi itu kemudian dituangkan ke dalam kolom,.
Ekstrak yang akan difraksinasi tersebut diletakkan diatas permukaan silca gel secara
merata. Setelah itu eluen dialirkan dan fraksi-fraksi yang diperoleh ditampung pada
vial yang disediakan. Fraksi di identifikasi dengan kromatografi lapis tipis dan yang
memberikan profil kromatogram yang sama disatukan dalam satu fraksi.

 Kromatografi lapis tipis preparatif, menggunakan plat kaca berukuran 20 x 20 cm

dengan fase diam silika gel PF254 yang telah diaktifkan dengan memanaskan selama
satu jam pada suhu 1100 C. Fraksi aktif yang telah dilarutkan pada pelarut metanol :
kloroform (1 : 1, v/v) diteteskan memanjang membentuk pita pada plat kaca dan
dielusi dengan fase gerak n-heksana : etil asetat (60 : 60 mL) + 3,6 mL asam asetat
glasial. Plat kaca dikeringkan dan diamati dengan sinar UV dengan panjang
gelombang 254 nm dan 366 nm. Pengambilan senyawa hasil KLT preparatif dengan
cara dikerik dan hasilnya dilarutkan dengan pelarut metanol : kloroform (9 : 1, v/v)
kemudian dikeringkan.

 KLT dua dimensi merupakan KLT yang menggunakan 2 eluen yang memiliki tingkat
kepolaran berbeda. Sampel yang ditotol merupakan hasil dari KLTP, yang ditotolkan
pada plat KLT hingga spot terlihat gelap jika diamati dibawah sinar UV. Disiapkan
plat KLT silika gel 60 F254 dengan ukuran 10 x 10 cm, plat dicuci dengan metanol
dan di aktivasi dalam oven pada suhu 110°C Selama 30 menit. Ekstrak murni yang
diperoleh, ditotolkan pada lempeng KLT PF 254 nm, dielusi menggunakan eluen
dengan tingkat kepolaran dan arah yang berbeda
 Setelah dielusi plat diangin anginkan selama 10 menit untuk menguapkan fase gerak
yang masih tersisa pada plat. Kemudian hasil elusi diamati menggunakan penampak
noda sinar ultra violet 254nm. dengan cara lempeng yang telah dielusi pada fase gerak
pertama diputar 90°, dan diletakkan dalam bejana kromatografi yang berisi fase gerak
kedua, sehingga bercak yang terpisah pada pengembangan pertama terletak dibagian
bawah sepanjang lempeng, lalu dikromatografi lagi. Hasil pengamatan yang
menunjukkan satu bercak atau satu spot tunggal menandakan senyawa isolat yang
diperoleh merupakan senyawa kimia tunggal atau murni

 KLT sistem multi eluen, Pengujian ini dilakukan dengan menotolkan isolat aktif pada
lempeng KLTkemudian dielusi dengan eluen aseton : etil asetat (2 : 1), heksan :
aseton (1 : 2) dan kloroform: aseton (1:4).
3. Apa perbedaan dan persamaan KLT Preparatif dengan KLT Analitik? (Sajikan dalam
bentuk tabel)
KLT Preparatif KLT Analitik (KLT 2 Dimensi)
Metode pemisahan senyawa (dari ekstrak) Metode pemisahan senyawa (dari isolate)
dengan cara meningkatkan resolusi sample
ketika karakterisiknya hampir sama (untuk
memperoleh senyawa murni)
Ukuran plat 20x20cm (Besar) Ukuran lempeng KLT 5x5 cm (Kecil)
Penjerap yang digunakan silica gel 60 GF Penjerap yang digunakan silica gel 60 GF
254 254
Eluen dijenuhkan terlebih dahulu dalam Menggunakan 2 fase gerak (2 eluen) dengan
chamber sebelum plat dimasukkan cara memasukkan plat ke dalam eluen
(menggunakan satu fase gerak) pertama , setelah selesai plat dikeringkan
terlebih dahulu kemudian plat diputar 90o
sebelum dimasukkan lagi ke eluen kedua.
Eluen kedua dapat berupa eluen yang sama
dengan eluen pertama atau berbeda.
Diamati pada lampu UV 254 dan UV 366 Diamati pada lampu UV 254 dan UV 366
Noda pada plat/lempeng dapat disemprot
dengan penampak bercak spesifik
Hasil pemisahan banyak dan dapat diambil
(dengan cara dikerok dengan spatel dari
setiap jarak pemisahan) untuk kemudian
senyawa murni + silica gel dapat di
rekristalisasi dan dilakukan KLT analitik
dari masing-masing jarak pemisahan (pita)
4. Metode apa saja yang dapat digunakan untuk uji kemurnian?
 a. Titik leleh/lebur

b. KLT 2 dimensi dengan 3 pengembang yang berbeda

c. Kckt

5. prosedur dan tujuan dari setiap metode uji kemurnian

a. titik leleh/lebur

Tujuan :

Titik lebur merupakan pengukuran yang penting untuk suatu senyawa, karena
titik lebur dapat digunakan untuk mengidentifikasi suatu zat dan
mengindikasikan kemuriannya.

prosedur:

 Mintalah zat yang akan ditentukan ttik lelehnya.

 Jika zat yang ditentukan kasar, maka digerus terlebih dahulu dalam mortar
sampai jadi serbuk halus.

 Ambil kapiler yang salah satu ujungnya tertutup , kemudian masukkan ujung
kapiler terbuka ke dalam serbuk zat asam benzoat sehingga kristalnya masuk
ke dalam kapiler.

 Kemudian angkat kapiler dari serbuk tadi dan dibalik sehingga ujung yang
tertutup menghadap ke bawah. Ketok dinding sel kapiler dengan jari secara
hati-hati sampai Kristal atau asam benzoat sampai berada di ujung bawah
kapiler.

 Ulangi langkah di atas sampai kapiler terisi dengan Kristal dari serbuk asam
benzoat.

 Ikatkan kapiler pada termometer, dimana ujung kapiler sejajar dengan ujung
bawah termometer.

 Kemudian pasang termometer pada standar dengan bantuan klem dan celupkan
termometer pada larutan parafin yang akan dipanaskan.
  Kemudian amati zat padat dalam Kristal dan temperatur, baca termometer bila
zat pada kapiler mulai meleleh dan disaat zat padat semua telah meleleh.
Kemudian catat range temperatur pelelehan.

 Singkirkan pemanas dan dinginkan pemanas untuk percobaan berikutnya.

b. KLT 2 dimensi dan 3 pengembang yang berbeda

Tujuan :

KLT 2 arah atau 2 dimensi ini bertujuan untuk meningkatkan resolusi sampel
ketika komponen-komponen solute mempunyai karakteristik kimia yang hampir
sama, karenanya nilai Rf juga hampir sama sebagaimana dalam asam-asam
amino

Prosedur :

Secara singkat pengerjaan KLT dua dimensi ialah sebagai berikut: Sampel
ditotolkan pada lempeng lalu dikembangkan dengan satu system fase gerak
sehingga campuran terpisah menurut jalur yang sejajar  dengan salah satu sisi.
Lempeng diangkat, dikeringkan dan diputar 90°, dan diletakkan dalam bejana
kromatografi yang berisi fase gerak kedua, sehingga bercak yang terpisah pada
pengembangan pertama terletak dibagian bawah sepanjang lempeng, lalu
dikromatografi lagi

c. Kckt

Tujuan :

untuk menentukan atau mengukur atau menganalisa kadar bahan aktif  pada suatu
sample(obat, makanan atau herbal). Pada beberapa kasus yang berhubungan
dengan obat herbal, alat ini digunakan untuk menentukan marker pada suatu obat
herbal.

Prosedur :

Prinsip kerja HPLC adalah pemisahan komponen analit berdasarkan

kepolarannya, setiap campuran yang keluar akan terdeteksi dengan detektor dan
 direkam dalam bentuk kromatogram. Dimana jumlah peak menyatakan jumlah
komponen, sedangkan luas peak menyatakan konsentrasi komponen dalam
campuran.

6. Prosedur

 Prosedur pemurnian KLT Preparatif Ekstrak Kunyit

Disiapkan bejana pengembang KLTP

(berisi larutan pengembang), biarkan
hingga bagian dalam bejana jenuh

 Disiapkan plat KLTP (20x20) fase diam silica gel

60 GF254
 Ditandai garis awal lempeng kromatografi dengan
jarak lebih kurang 1 cm dari tepi lempeng, tandai
dengan pensil titik-titik garis yang akan di totolkan
ekstrak
 Totolkan ekstrak kunyit berupa garis, biarkan
kering (pentotolan dilakukan berulang kali) untuk
memperoleh kadar ekstrak yang cukup
 Dimasukan lempeng secara berhati-hati dan tegak
lurus dalam bejana pengembang, pastikan garis
awal tidak terendam, biarkan hingga larutan
pengembang mencapai batas lebih kurang 1 cm
dari tepi atas lempeng kromatografi
 Angkat lempeng bejana, biarkan kering, amati di
bawah sinar ultraviolet 254 mm dan 366 mm,
tandai pita yang teramati, lempeng tutup dengan
kaca. Sisi lempeng semprot dengan penampak
bercak asam sulfat pekat 10% dalam etanol atau
penampak bercak spesifik, amati warna dan
jumlah bercak
 Kerok masing-masing pita pemisahan , larutkan
dalam pelarut metanol
 Filtrat yang mengandung pemisahan uapkan

Lakukan pemantauan masing-masing

pita pemisahan dengan KLT analitik
  Prosedur uji kemurnian KLT 2 Dimensi Kunyit

Isolat kunyit yang telah diperoleh

ditotolkan pada lempeng KLT 5X5 cm


Dielusi isolate dengan menggunakan n-heksan-etil asetat
(8;2 dan 5;5)
 Elusi pertama lakukan dengan cara menotolkan filtrate
kunyit yang telah dilarutkan dengan pelarut methanol lalu
dielusi, selanjutnya elusi kedua lakukan dengan cara
Daftar Pustaka memutar lempeng 90̊ berlawanan arah jarum jam sehingga
Arif satria (2020). hasil elusi
PENGGUNAAN pertama menjadi
INSTRUMEN titik awal pengelusian untuk
HIGH-PERFORMANCE LIQUID
proses elusi kedua
CHROMATOGRAPHY SEBAGAI METODE PENENTUAN KADAR KAPSAISIN
PADA BUMBU MASAK KEMASAN “BUMBU MARINADE AYAM SPECIAL”
Amati pada
MEREK lampu
SASA. UV254 dan
Farmaka UV36614 Nomor 2
Volume

Hidayati.nur,2012.ISOLASI DAN PENETAPAN KADAR SENYAWA ANTIFUNGAL p-

Methoxybenzylidene p-aminophenol DARI AKAR Acacia mangium[Isolation And
Concentration Determination Of Antifungal Compound P-Methoxybenzylidene P-
Aminophenol From Acacia Mangium Root].jurnal Pemuliaan Tanaman Hutan.
Https://media.neliti.com .Vol 6 No. 2, 117 – 130

tim Dosen,2021.Modul praktikum kimia bahan alam. Universitas garut

Dewi dkk,2018.Pemisahan, Isolasi, dan Identifikasi Senyawa Saponin dari Herba Pegagan
(Centella asiatica L. Urban).Jurnal Farmasi Udayana, Vol 7, No.2, 68-76.
Https://media.neliti.com

Andi Dkk,2014.ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA ANTIBAKTERI EKSTRAK

NHEKSAN DAUN JATI (Tectona grandis L.F).JF FIK UINAM Vol.2 No.1

Titik Leleh Dan Titik Didih. Diakses pada tanggal 17 september 2021 pada link :
https://docplayer.info/70627016-Titik-leleh-dan-titik-didih-i-tujuan-percobaan-
menentukan-titik-leleh-beberapa-zat-menentukan-titik-didih-beberapa-zat-ii.html.
Wulandari, Lestyo. 2011. KROMATOFRAFI LAPIS TIPIS. Jember: PT. Taman Kampus
Presindo